材料和试剂

从植物或动物组织中分离的DNA（注1）
栓模具（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3713）
限制酶 - 频繁切割酶限制性酶例如Mse I（New England Biolabs，目录号：R0525L），Alu I（New England Biolabs，目录号：R0137S），Bst NI（New England Biolabs，目录号：R0168S），Hae III（New England Biolabs，目录号：R0108S） I（New England Biolabs，目录号：R0155L），Rsa I（New England Biolabs，目录号：R0167S）
注意：反应缓冲液由制造商提供。
BAL31核酸酶（New England Biolabs，目录号：M0213L）
50mM乙二醇双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（pH8.0）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：11 290.02）
0.5M EDTA（pH8.0）（Duchefa Biochemie，目录号：E0511）
电泳用琼脂糖（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：11404.05）
用于脉冲场凝胶电泳（PFGE）的琼脂糖（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0138）
低熔点琼脂糖（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-3112）
溴化乙锭水溶液1％w/v（10mg/ml）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：2125.01）
DNA装载缓冲液（6倍浓缩）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）
用于常规琼脂糖电泳（例如GeneRuler 1kb DNA Ladder）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0311）的DNA标记物
用于PFGE的DNA标记[例如中档或低范围PFG标记（New England Biolabs，目录号：N3551S或N0350S）]
0.25 M HCl（Penta Technologies，目录号：77232）
0.4 M NaOH（Penta Technologies，目录号：71691）
100mM PMSF（异丙醇）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：32395）
来自Tritirachium的蛋白酶K 8 DMC-U/mg（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：33752.02）
N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：L5125）
D-甘露醇（Duchefa，目录号：M0803）
尼龙膜（Hybond XL）（GE Healthcare，目录号：RPN303S）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201L）
DecaLabel DNA标记试剂盒（Life Technologies，目录号：K0622）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，目录号：K0622"。
^{32 P-γ-ATP [例如同位素研究所（匈牙利，目录号：FP-501）]}
同位素研究所（匈牙利，目录号：FP-203）] P-α-dATP（或³² P-α-dCTP）
合成端粒寡核苷酸（4端粒重复（CCCTAAA）4或（TTTAGGG）4）或端粒连接子
NaCl
Tris-HCl（pH 8）
MgCl 2
CaCl <2>
冰醋酸
硼酸
NaH 2 PO 4 sub
Na HPO ₄
SDS
SSC
BAL31核酸酶缓冲液（参见Recipes）或可购买（New England Biolabs，目录号：B0213S）
50x TAE（请参阅配方）
5x TBE（参见配方）
杂交缓冲液（参见配方）
洗涤液（见配方）
TE缓冲区（参见配方）
TEM缓冲液（参见配方）
蛋白酶缓冲液（参见配方）

设备

用于标准琼脂糖凝胶电泳的装置（例如Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ）
PFGE电泳仪;为了获得最佳分辨率结果，使用具有六边形电极的系统（例如，CHEF DR，Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec 或Gene Navigator，Amersham）
热块（例如：Eppendorf，型号：Thermomixer）
真空浓缩器（例如 Thermo Fisher Scientific，型号：SpeedVac）
真空吸印器（例如Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ）
凝胶文件系统（例如，R& D Systems，FujiFilm，型号：LAS3000）
杂交炉[例如 HybriLinker（Analytik Jena，型号：UVP）]
Phosphoimager（例如GE Healthcare Dharmacon，型号：FLA7000）

软件

多量程信号处理软件（FujiFilm）

程序

限制性内切酶消化
基于预期的端粒长度，消化通过标准方法（端粒10kb）或高分子量DNA（端粒> 10kb）分离的DNA。
1. 通过标准方案分离的基因组DNA的消化
  1. 选择适当的限制性内切核酸酶或酶的混合物。这些应该（i） ?经常切割，在规范内没有识别网站端粒重复，（ii）在类似的反应条件下裂解（缓冲液， ?温度最优），（iii）在工作中显示相对长的存活温度，和（iv）对胞嘧啶甲基化不敏感。
    限制酶和实验条件的实例：Mse I，37 C; Alu I，37℃; I + Hae III，37°C; Hinf I + RsaI，37℃; Bst NI，60 ℃。
  2. 消化?1μg基因组DNA与20 U酶（或酶混合物）3小时。加入下一等份的酶和消化O/N。
  3. 如果需要将样品加载到琼脂糖凝胶上，使用真空浓缩器减少反应混合物的体积。
2. 高分子量DNA的消化
  1. 选择合适的限制性内切核酸酶或酶的混合物。
  2. 孵育DNA嵌入琼脂糖塞（注1）在200-300微升相应的限制性缓冲液在2ml Eppendorf管中30分钟在消化温度下（注2）
  3. 更换通过新鲜的等分试样（200μl每1个琼脂糖块，300μl） μl每2个琼脂糖块），加入限制酶（30U/l琼脂糖块），并孵育3小时。加入下一等份的酶并消化 O/N。
  4. 通过PFGE在琼脂糖塞中分析DNA。分数低在消化过程中释放到反应中的分子量DNA ?缓冲液可以通过苯酚 - 氯仿提取分离并分析常规琼脂糖凝胶电泳。
3. 可选：在限制酶处理之前用BAL31核酸酶消化
  为了确定推定的端粒序列的末端位置，高分子量DNA（注1）用BAL31核酸酶处理降解末端序列。在TRF分析中，损失在BAL31消化过程中的端粒特异性杂交信号。
  1. 取6个或更多DNA琼脂糖块（基于 BAL31消化时间间隔的数目，例如，0,10,20,40,60,90 min），将每个置于2ml Eppendorf管中，加入200μlBAL31反应物缓冲液，在30℃温育30分钟。
  2. 更换反应缓冲液通过新鲜等分试样（200μl），将管在热中孵育块（30℃），加入3U的BAL31核酸酶（零时间样品除外）并消化各自的时间（消化时间例如<10ms，20℃，40℃，60℃， ?90分钟）。
  3. 通过去除限制性缓冲液并加入500μl50mM EGTA（pH 8）停止反应
  4. 通过在55℃孵育30分钟灭活BAL31
  5. 用1.5ml的0.1×TE缓冲液替换EGTA，在4℃下孵育15分钟。重复洗涤步骤至少两次。
  6. 继续用限制性内切酶消化（参见步骤A2）。
通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA
1. 常规琼脂糖电泳（分离预期长度为10kb的末端片段）
  1. 准备在1X TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶。
  2. 将凝胶冷却至约60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/ml。
  3. 向DNA样品中加入DNA上样缓冲液，加载到凝胶上。加载DNA标记（1kb DNA梯）。
  4. 运行电泳（1.2-2.6 V/cm），检查DNA标记片段的位置
  5. 使用文档系统记录凝胶（在模式中溴化乙锭 - 在312nm激发）。拟南芥的一个例子使用常规琼脂糖凝胶电泳分离的拟南芥DNA ?如图1A所示
  6. 转移DNA到尼龙膜毛细管或真空碱吸印（在0.25M HCl中脱嘌呤，变性和在0.4M NaOH中转移），与放射性杂交标记的端粒探针（参见步骤C3）。
2. 凝胶电泳（分离期望长度> 10kb的末端限制性片段）
  1. 在0.5x TBE缓冲液中制备1％琼脂糖凝胶
  2. 将0.5 TBE缓冲液倒入PFGE装置中，预冷至14℃
  3. 使用机器软件设置电泳参数或手动（例如，），对于范围在10和200kb之间的DNA片段，适当的参数为6V/cm，开关时间从1至12秒 15小时）。
  4. 加载DNA样品在琼脂糖插入凝胶，加载DNA标记。
  5. 分离后，用0.5μg/ml溴化乙锭染色凝胶 0.5x TBE 15分钟，使用文档系统的文档。一个例子图中显示了使用PFGE分离的烟草（Nicotiana tabacum）DNA 1B。
  6. 通过毛细管或真空转移DNA到尼龙膜碱性印迹，与放射性标记的端粒探针杂交（参见步骤C3）。
端粒探针和杂交的放射性标记
1. 端粒寡核苷酸的末端标记（注3）
  1. 准备末端标记反应混合物在室温：6.5μl水，5μl 10μM合成端粒寡核苷酸，2μl10×浓缩 T4多核苷酸激酶缓冲液，5μl的32P-γ-ATP（1.85MBq），1μl的 T4多核苷酸激酶。
  2. 在37℃孵育30分钟。热灭活酶（2分钟/94℃）
  3. 将混合物直接加入杂交溶液中（参见步骤C3c）。
2. 通过随机引发（注3）标记端粒连环体
  1. 通过非模板PCR制备端粒多联体，如（Ijdo等人，1991）中所述。
  2. 根据DecaLabel DNA中的说明，使用32 P-α-dATP或32 P-α-dCTP（1.85 MBq）对端粒连接子进行末端标记标签工具包。
  3. 使探针在95℃变性10分钟，置于冰上。将探针加入预热的杂交溶液中（参见步骤C3c）。
3. 杂交
  1. 在55℃下在杂交缓冲液中预杂交膜1小时在杂交炉中缓慢旋转的圆筒中。体积用于预杂交的杂交缓冲液取决于大小气缸;共同体积为30-50ml。
  2. 更换杂交缓冲液通过预热的新鲜等分试样。保持杂交体积 ?缓冲器尽可能低;共同体积范围在10-20ml之间
  3. 将所有体积的放射性标记的探针（来自C1或C2）加入杂交缓冲液
  4. 在55°C O/N（或至少16小时）杂交
  5. 倒出杂交溶液（放射性废物容器），加入洗涤溶液（洗涤溶液的体积取决于圆筒的尺寸;共同体积为50-80ml），在杂交炉中在55℃孵育15分钟。重复洗涤步骤两次
  6. 弃去洗涤液，用2x SSC和水冲洗膜，将湿膜包装在Saran包装上
  7. 将膜暴露于phosphoimager屏幕。时间的暴露取决于放射性信号强度，范围为6 h ?至24小时。
杂交信号的评价
1. 使用phosphoimager可视化杂交信号。
2. 评估使用可用工具的数据，例如，TeloTool（Gohring ，，2014）（Grant et al。，2001）或TELORUN（Baur et al。，2004）。选择适当的处理工具取决于分布的端粒杂交信号 - 详见注4。
  例子的TRF分析示于图2A（拟南芥端粒）和图2B（烟草（Nicotiana tabacum）端粒）中。
  
  图1。拟南芥（Arabidopsis thaliana）DNA（A）和脉冲的常规电泳烟草的DNA凝胶电泳（B）。 A。被隔绝的DNA 来自拟南芥（生态型哥伦比亚）叶片用Mse I/I消化，在1％TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上电泳。 B.高分子量DNA 分离自N。烟草叶叶用 Taq I（泳道1）， Mse I （泳道2）和Hinf I + Hae III（泳道3），并在0.5×TBE中通过PFGE分析缓冲。 N-未消化的DNA; M-DNA标记（低范围PFG标记）。
  
  图2.通过TRF方法分析拟南芥（A）和烟草（B）植物物种的端粒。 A.分离的DNA 来自 A。用Mse I消化拟南芥（哥伦比亚生态型）叶片，通过常规琼脂糖电泳分析并使用杂交放射性标记的端粒寡核苷酸。这端的端粒物种约3kb长。箭头指示ITR条带的位置; N-未消化的DNA; M-DNA标记（GeneRuler 1kb DNA Ladder）。 B.高分离自N的分子量DNA。用泳道1（泳道1），泳道2（泳道2）和泳道1（泳道2）和泳道4中的泳道1和泳道4消化tabacum Hae III（泳道3），通过分析 PFGE并使用放射性标记的端粒进行杂交寡核苷酸。烟草的末端限制性片段高度长度不均一（20-160kb）。 N-未消化的DNA; M-DNA标记（低范围PFG标记）。

笔记

为了获得准确和可重复的数据，DNA的完整性至关重要。对于通过常规电泳分析端粒长度（预期的端粒长度为10kb，不进行BAL31分析），使用任何标准的DNA分离方法（例如，苯酚 - 氯仿萃取或基于柱的纯化商业试剂盒）。通过琼脂糖凝胶电泳仔细检查DNA的长度;在压缩区域（长度> 20kb）中的尖锐带应该是可见的为了避免在分离期间的剪切，建议在脉冲场凝胶电泳（预期的端粒长度> 10kb）中用于在琼脂糖塞中制备DNA，并且用于通过BAL31核酸酶消化分析端粒重复的末端位置。在琼脂糖塞中制备高分子量DNA：将1g植物组织在液氮中匀浆。将匀浆与1ml TEM缓冲液（缓冲液在水浴中预热至45℃）混合，在厚悬浮液的情况下，加入更多的TEM缓冲液。然后加入1体积的在TEM缓冲液中的2％低熔点琼脂糖（在水浴中预热至45℃），并通过吸移混合。将混合物转移到一次性塞模中。通过蛋白酶K处理（在蛋白酶缓冲液中在37℃下3×24小时，每24小时添加新鲜蛋白酶K）纯化琼脂糖栓塞中的DNA。通过PMSF处理（1mM PMSF，在1x TE缓冲液中，10℃，3×30分钟）使蛋白酶K失活，并通过0.1×TE缓冲液（室温下3×30分钟）洗涤栓塞。在通过限制酶或BAL31消化之前，将琼脂糖栓中的高分子量DNA在4℃下储存在0.25M EDTA中。
小心，当使用嵌入低熔点琼脂糖块中的DNA处理时，不要使用高温。（例如，分别为识别序列TCGA和TTAA）中的常用酶的消化温度，其中所述限制性内切核酸酶是分别为TRF，Taq或Tru 65℃。在该温度下孵育琼脂糖栓塞导致它们的解链和实验褪色。低于最佳温度（例如55-58℃）可以与这些酶一起使用，或者这些酶应该被具有较低温度最佳值的酶替换（例如，而不是 1I，使用其异构体 Mse I，反应最适宜在37℃）。
两种不同类型的探针已经用于在TRF分析中探测端粒：合成的端粒寡核苷酸和串联的端粒寡核苷酸（串联体）（Fajkus等人，1995; Fajkus等人， 2005; Ijdo等人，1991; Neplechova等人，2005; Peska等人，2015; Sykorova等人，2005; et al。，2003）。合成的端粒寡核苷酸的优点是靶序列被明确定义。另一个优点是使用合成的端粒寡核苷酸获得链特异性信息的可能性，例如富含G的端粒单链DNA的突出端的特异性检测（Polanska等人，2012）。使用PCR和针对推定的端粒序列的两条链设计的合成寡核苷酸制备第二种类型的端粒探针多联体。这些被连接成具有广泛的探针长度异质性的复杂探针（Ijdo等人，1991; Peska等人，2015），但是具有令人惊奇的序列同质性（Neplechova et al。，2005）。
端粒长度（TL）可以使用以下方法评估：TeloTool，Telometric 1.2，TELORUN。每个都有自己的优势和弱点。 TeloTool（Gohring等人，2014）通过自动检测样品泳道和标记物，提供了非常快速，准确，可重复和容易使用的端粒信号测量。在建立样品泳道和标记物的强度分布和探针校正之后，可以立即计算TL。该方法基于高斯函数与杂交信号强度的拟合。拟合高斯曲线用于计算相关统计量（平均值，标准偏差和TL范围）。因此，TeloTool适合用于评估具有正态分布的杂交信号强度的TL。 TL评估的质量 - 曲线描述样本数据的程度 - 由确定系数描述。在不对称分布的数据的情况下，推荐使用Telometric 1.2（Grant等人，2001），其允许计算TL的中值，其更适当地反映端粒的实际长度。另一方面，直升机1.2可能遭受对TL的过度估计。两种方法的详细比较参考（Gohring等人，2014）。 TL也可以通过多仪表信号处理软件（FujiFilm）手动测量，然后计算统计。简言之，使用DNA标记作为标准，将杂交模式中的所有样品泳道划分为对应于相同分子量区间的矩形，并且未加权平均端粒长度计算为Σ（ODi×Li）/Σ（ODi），其中ODi是在区间i内的杂交信号强度（高于背景），Li是区间i的中点处的分子量。这种方法是相当准确的，但是结果可能由于人为因素，即在矩形车道分段和背景减除期间。计算统计及其图形输出可以通过TELORUN容易地生成，TELORUN是具有预设计算公式的excel表，其可以在URL（ http://www.swmed.edu/home_pages/cellbio/shaywright/research/sw_lab_methods.htm ）（Baur等人，2004）。

食谱

BAL31核酸酶缓冲液
600 mM NaCl
20mM Tris-HCl（pH8）
1mM EDTA
12mM MgCl 2/
12mM CaCl 2
50x TAE
242克三碱基
18.61g EDTA
57.1ml冰醋酸水至1 L
5x TBE
54克Tris碱，27.5克硼酸，20毫升0.5M EDTA（pH8），水至1升
杂交缓冲区
0.25M NaH 2 PO 4 + Na 2 HPO 4（为了得到最终pH 7.5）。
7％SDS，0.016M/dm EDTA
洗涤溶液
2×SSC [1×SSC：150mM NaCl，15mM柠檬酸钠（pH7）] 0.1％SDS
TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH8）
1mM EDTA（pH8）
TEM缓冲区
1mM Tris-HCl（pH8）
50 mM EDTA
0.4 M D-甘露糖醇
蛋白酶缓冲液
0.25 M EDTA（pH 8）
10mM Tris-HCl（pH8）
1％N-月桂酰肌氨酸

致谢

该协议改编自以前的工作（Fajkus等人，2008）。这项工作得到了捷克共和国赠款机构（13-06595S，13-06943S）和来自欧洲区域发展中心的"CEITEC-中欧理工学院"项目（CZ.1.05/1.1.00/02.0068）基金。

参考文献

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Fajkus，J.，Kovarik，A.，Kralovics，R。和Bezdek，M。（1995）。在高等植物Nicotiana tabacum中组织端粒和亚端粒染色质。 Mol Gen Genet 247（5）：633-638。
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Gohring，J.，Fulcher，N.，Jacak，J.和Riha，K。（2014）。 TeloTool：用于端粒限制性片段分析的端粒长度测量的新工具，具有改进的探针强度校正。/a> Nucleic Acids Res 42（3）：e21。
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