材料和试剂

1.5 ml管
叶片
注意：确保叶片完全浸没在DMF溶液中。
N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（Sigma-Aldrich，目录号：D4551-250ml）

设备

分光光度计（Spectronic Biomate3）（Thermo Fisher Scientific，目录号：335904P）
玻璃分光光度计比色杯（Sigma-Aldrich，目录号：Z276898）
注意：产品Z276898已停产。

程序

将三片叶片（例如，4mm半径，来自Eppendorf盖）放入含有1ml二甲基甲酰胺（DMF）的1.5ml管中。使用软木钻孔器切除叶盘。每个样品类型包括五个重复。确保叶圆片完全浸没在DMF溶液中。在4℃下孵育过夜，使叶绿素溶解在DMF溶液中
将300μl样品溶液与600μlDMF在新鲜的Eppendorf管中混合（每体积样品2倍体积的DMF）。使用玻璃比色皿读取分光光度计在647 nm和664.5 nm波长的吸光度（A）。
叶绿素 a 内容（μg/ml）：
=（12×A <664.5） - （2.79×A 647 ）
叶绿素 b 内容（μg/ml）：
=（20.78×A 647） - （4.88×A 664.5 ）
总叶绿素含量（μg/ml）= Chl a + Chl b 样品面积（对于4mm半径的3片叶片）（mm 2）= 3×πr2
总叶绿素含量（μg/mm 2 ）=（Chl a + Chl b ）/示例区域

笔记

该方案最适合于比较实验中的处理，因为绝对叶绿素含量将在不同组的植物之间和随时间变化。如果在叶浸润测定后测量叶绿素含量，优选在单叶上渗透所有待比较的处理类型。这可以在不同的配置中在多个叶子上重复。为了使叶间变异性的影响最小化，然后可以汇集来自相同处理类型的所有叶盘。每种治疗类型需要至少15个叶盘（每个样品3个，重复5次）。虽然我们对这个协议的经验已经使用烟草的叶片和 N。 tobacum ，它也已被应用于（至少）拟南芥（Pruzinska等人，2005） - 作为叶衰老的代表，并且可以主要应用于许多其他叶绿素含量具有生理相关性的植物物种。

致谢

我们要感谢Sylvain Aubry在建立这个协议的灵感。 Baulcombe实验室的研究由ERC高级研究者奖励ERC-2013-AdG 340642 TRIBE支持。 C. J. H由BBSRC博士支持。学生。 D. C. B.是皇家学会爱德华·彭利亚伯拉罕研究教授。

参考文献

Harris，C.J.，Slootweg，E.J.，Goverse，A.and Baulcombe，D.C。（2013）。植物病害抗性基因的逐步人工进化。 Proc Natl Acad Sci USA 110（52）：21189-21194。

Pruzinska，A.，Tanner，G.，Aubry，S.，Anders，I.，Moser，S.，Muller，T.，Ongania，KH，Krautler，B.，Youn，JY，Liljegren，SJand Hortensteiner，S 。（2005）。拟南芥叶片衰老中的叶绿素分解。参与去细胞反应的叶绿素分解代谢物和叶绿素分解代谢酶的表征。植物生理学139（1）：52-63。

Strain，H.H.，Cope，B.T.and Svec，W.A。（1971）。叶绿素的分离，鉴定，估计和研究的分析程序。 Methods Enzymol 23：452-476