材料和试剂

保护玻璃厚度No.122×22mm（Marienfeld-Superior，目录号：0101050）
Fisherfinest Premium显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：125447）
组织培养24孔板（TPP Techno Plastic Products AG，??目录号：92024）
组织培养96孔板（TPP Techno Plastic Products AG，??目录号：92096）
硼硅酸盐玻璃毛细管3.3。（Hilgenberg GmbH，目录号：1409363），尖端直径约100μm的手动移液管（Hilgenberg GmbH）
来自Eppendorf的15ml无RNA酶（Sigma-Aldrich，目录号：0030123.328）的微量管
注意：可用性目前不可用。
铝箔（29cm×150μm）（MAIS.s.r.o.）
来自六周龄雌性CD1小鼠的卵母细胞;生物方案中描述的小鼠卵母细胞的分离（Tetkova和Hancova，2015），也是（Susor等人，2015）
多聚甲醛终浓度在PBS（储存在-20℃）中为4％（Thermo Fisher Scientific，Afla Aesar，目录号：30525894）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：30525894"。
Triton X-100最终浓度2％在1×PBS（新鲜）（Sigma-Aldrich，目录号：9002931）中2％
在实验的同一天（Sigma-Aldrich，目录号：S6639）将20x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）原液稀释于无RNA酶的水中
乙醇100％（用于终浓度70％乙醇，用DEPC水新鲜稀释100％乙醇）（Merck Millipore Corporation，目录号：1085430250）
VECASHIELD HardSet TM TM/DAPI（储存2-8℃）（Vector Laboratories，目录号：H1500）
Protectx RNA酶抑制剂500x浓缩（最终工作浓度为1x;在2-8℃下在黑暗中储存）（Sigma-Aldrich，目录号：R7397）
Stellaris探针（库存浓度5nmol）（Bioresearch Technologies）
无核酸酶水（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9932）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM ，目录号：AM9932" />
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
聚（乙烯醇）（PVA）（Sigma-Aldrich，目录号：341584）
甲酰胺（5ml，10％终浓度）（Sigma-Aldrich，目录号：F7503）
来自明串珠菌（Leuconostoc）的硫酸葡聚糖钠盐。（Sigma-Aldrich，目录号：D8906）
洗涤缓冲液（见配方）
杂交缓冲液（参见配方）
隔离缓冲液PVA（参见配方）

设备

立体显微镜Zeiss 2000C（Thermo Fisher Scientific）
加热板（P-lab）
Multi Bio 3D mini-Shaker（Biosan Laboratories）
恒温培养箱mini I5110（Labnet International）
共聚焦显微镜Leica SP5（Leica Microsystems）
适用于荧光团和激发激光器的滤光片组
40x或63x或100x油浸物镜

程序

卵母细胞的固定和透化
1. 在400μl分离缓冲液PVA中洗涤分离的卵母细胞，然后将卵母细胞转移到400μl的4％PFA中25分钟室温。
2. 将卵母细胞转移到24孔培养皿中，用500μl/孔的2％Triton X-100与1x ProtectRNA RNase抑制剂在室温下孵育10分钟
3. 代替步骤A2，在室温下用70％乙醇渗透卵母细胞20分钟注意：在固定后立即进行杂交。
准备探针和杂交
注意：
1. 首次使用Stellaris探头时，建议从4开始使用通过加入1μl各1:50,1:100， 1：200,1：400工作稀释度的探针，以了解哪一种是最佳的。阴性对照eGFP，无探针，Malat 1（图1）。
2. 温暖杂交缓冲液至室温并混匀。自旋25μM 工作母液探针稀释至100 nM 200x倍至最终浓缩成杂交缓冲液。
1. 500μl37℃预热的洗涤缓冲液，含1×保护RNA RNA酶抑制剂，用于15分钟的补液细胞。
2. 转移卵母细胞到96孔板用100μl/每孔杂交缓冲液，并添加探针
3. 通过铝箔保护96孔板免受光照，在37℃的恒温培养箱中孵育过夜注意：抖动不是必要步骤，可能会被省略。
杂交后洗涤和安装
1. 在150μl2x SSC中洗涤1次，每次5分钟，摇动30RPM，在96孔板上以30秒转动角度360°。
  转移卵母细胞96孔板用125微升/每孔的温水洗涤缓冲液。在37℃下孵育至少50分钟。
  注意：震动不是必要步骤，可能会被省略。
2. 在室温下，在150μl的2x SSC中冲洗1次，每次2分钟
3. 将卵母细胞与0.5微升的SSC液体在载玻片上与20微升 Vectashiled硬化封固剂用DAPI，等待1分钟，然后盖与盖玻片。
图像样本
1. 离开幻灯片在暗室在4℃下2小时。
2. 接下来，用共焦激光扫描显微镜扫描。
3. 在同一天拍摄图像，以避免样品干燥和荧光衰退。
成像设置
卵母细胞的典型设置有两个通道（红色，蓝色）和客观HCX PL APO lambda 63.0 x 1.25 OIL UV。另一个设置：为了可视化Cal面粉635标记探针使用633激光618 nm激发和发射635 nm波长，激光功率设置为10％，扫描速度100 Hz，图像格式512 x 512，松孔110μm，Z - 堆叠厚度：10μm，并通过LAS AF进行图像分析和合并注意：为了能够比较图像，请确保不同实验之间的设置相同（例如激光强度，增益，偏移，扫描速度等）。

阴性对照，无探针杂交

实验阴性对照。卵母细胞没有 eGFP mRNA（绿色）

在高探针浓度（1:50）的卵丘细胞中的 Malat1（绿色）的特异性信号。卵母细胞显示出高背景
图1. FISH协议的优化

图2.只有卵母细胞表达dazl mRNA，而卵丘细胞在针对dazl mRNA后的FISH后没有显示绿色信号。卵母细胞DAPI （蓝色），比例尺为10μm

图3.小鼠卵母细胞的GV期与cMos mRNA的绿色信号。 DAPI（蓝色），比例尺为10μm。

食谱

洗涤缓冲液（50ml）
20×SSC（5ml）甲酰胺（5ml，10％终浓度）无核酸酶水（至最终体积为50ml）
注意：将体积分成5毫升等分试样，冷冻保存在-20°C。
杂交缓冲液（10ml）
硫酸葡聚糖（1g）
20x SSC（1ml）甲酰胺（1ml，10％终浓度）无RNA酶，储存在2-8℃下无核酸酶水（至10ml终体积）
注意：将体积分成0.5ml等分试样，冷冻并储存在-20℃。
分离缓冲液PVA（50ml）
磷酸盐缓冲液（50ml终体积） PVA 2mg
保护RNA RNA酶抑制剂1x浓缩物
注意：用与杂交缓冲液相同百分比的甲酰胺冲洗缓冲液。

致谢

这项工作是由研究资助1）布拉格的查尔斯大学，细胞生物学学院 - GAUK 243-227026和2）GACR 13-12291S支持。所描述的协议的一些原理已经改编自Singer Lab Protocol：Published 1998和Christian Lanctot Protocol。原始的作品发表在Susor等人（2015）。

参考文献

生物研究技术：设计和订购单分子FISH探针。
Femino，A.M.，Fay，F.S.，Fogarty，K。和Singer，R.H。（1998）。原位显示单个RNA转录物。 > Science 280（5363）：585-590。
Flemr，M。和Svoboda，P。（2011）。小鼠卵母细胞中的核糖核蛋白定位。方法 53（2 ）：136-141。
Susor，A.，Jansova，D.，Cerna，R.，Danylevska，A.，Anger，M.，Toralova，T.，Malik，R.，Supolikova，J.，Cook，MS，Oh，JSand Kubelka，（2015年）。通过mTOR-eIF4F通路在哺乳动物卵母细胞中翻译的时空和空间调节。 Nat Commun 6：6078.