材料和试剂

显微镜盖玻璃
显微镜载玻片
珍珠岩（Maasmond-Westland，荷兰）
7天龄的幼苗。 truncatula （种子可以在The Samuel Roberts Noble基金会获得）
可以包含pUB：GFP-MtVTI11或pLB：GFP-MtVTI11二元载体（参见注释1）
的毛发土壤杆菌MSU440菌株（可以在荷兰瓦赫宁根大学的分子生物学实验室获得） >
Sinorhizobium meliloti 2011（见注2）
含有3％蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）的0.1M磷酸钠（Sigma-Aldrich目录号：S8282和S7907）缓冲液（pH7.2）。有关制备方案，请参见Sambrook和Russell（2001）
注意：磷酸二氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）和磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
10μg/ml碘化丙啶（4℃保存）（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
1％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15700）
0.75％戊二醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：16000）
50mM磷酸盐缓冲液（Sambrook和Russell，2001）
固定剂（见配方）

设备

荧光立体显微镜（Leica Microsystems，型号：MZFLIII）
具有数码相机的共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：Axiovert 100M）
剃刀刀片
精细镊子（结构探针，Dumont，型号：0T05B-XD）

软件

IMARIS软件（Bitplane），带有用于数据管理，可视化，3D渲染和分析的模块
Zeiss LSM图像浏览器

程序

转基因结节的生成
1. 通过毛根土壤杆菌 ^{产生 pUB：GFP-MtSYP22 或
  pLB：GFP-MtSYP22 - 介导的7天龄的转化 M的幼苗。 truncatula 。转化方案参见Limpens等人 et al。（2004）。转化后植物生长14天}
2. 复合材料的接种。具有 pUB：GFP-MtSYP22 或
  pLB：GFP-MtSYP22 转基因根的转基因植物 meliloti ）2011（Sambrook和Russell，2001）。复合苜蓿植物转基因根转移到用没有Ca（NO 3）2（Limpens等人，2004）的F?rhaeus培养基饱和的珍珠岩。 2天后，用2ml的S接种植物。 meliloti 2011培养物（OD 600nm为0.1），并生长2周（21℃; 16/8h光/黑暗）。
图像采集的样品准备
1. 使用a。选择转基因结节（接种后14天）荧光立体显微镜，具有DsRED1滤光片设置（图1A-B）
2. 收获的结节用镊子收集在Eppendorf管中，500μl固定剂在4°C固定1小时。
3. 在磷酸盐缓冲液中用剃刀刀片对固定的结节进行手工切片（图1C）。尽量做尽可能薄的部分。
4. 结节切片用镊子在Eppendorf管中收集 ?碘化丙啶溶液在室温下染色10-20分钟
5. 将结节切片放在一滴磷酸盐缓冲液中的微观上 ?玻璃载玻片。然后将盖玻片的边缘放在样品上小心降低盖子;确保组织之间没有空气玻璃
  
  图1.苜蓿根瘤的收集和切片。A.苜蓿根瘤。 B.转基因根上的苜蓿根瘤 ?（基于从DsRED1产生的红色荧光选择表达）。 C.结节切片。
图像获取
1. 观察在共焦显微镜下使用油的结节部分浸没物镜（x63或更高），具有488nm激发和 505-530 nm发射波长为GFP和543 nm激发和 636nm发射波长。过滤器：Ch1：LP560， Ch2：BP505-530。针孔：106μm
2. 在感兴趣的发育阶段找到一组感染的细胞，并专注于它
3. 获取感兴趣区域的Z堆栈串行图像。 Z堆叠大小： 512 x 512 x 20-73像素。 Z-stacks中的单个图像数量20-67 这取决于被扫描细胞的位置和大小。使用投影工具，您可以创建3D投影图像或3D中的旋转，这可以 ?动画并导出为AVI电影（图2，视频1）。
  
  图2.结节细胞的Z-堆叠系列图像的3D投影表达GFP-MtSYP22 （绿色）。细菌和类菌体形成对照通过碘化丙锭（红色）。 ic，感染细胞;它，感染线程; v，液泡。比例尺40μm
  
  视频1.结节细胞的3D投影
图像处理：感染细胞中液泡和共生体的3D渲染和体积/面积测量
1. 使用IMARIS软件打开Z-stack系列结节的结节。
2. 通过3D裁剪操作选择感兴趣区域进行进一步操作（图3）。
3. 如果图像太暗无法查看，请在显示调整窗口中单独调整通道的亮度
4. 为了摆脱焦点光或其他人工制品之前测量，请在"图像处理"菜单中选择"平滑"。选择通道您想要过滤和滤除噪声信号从 3D图像。
5. 产生液泡和共生体的表面表面生成向导中的受感染单元格（选择源通道分割：对于液泡选择GFP通道和共生体RFP通道）。生成整个被感染的表面单元格，使用手动3D构造模式
6. 调整阈值（调整时阈值区域显示为灰色）。
7. 生成的和完整的表面将存在于图像中改变颜色（图3B）。你可以从你的测量按下测量图标（Imaris Measurement）。如果必要时，调整测量参数并使用滤波器。使用 Movie Maker您可以使用生成的曲面创建动画（视频2）。
  
  图3.感染细胞在细菌瞬间的3D渲染在苜蓿根瘤中释放。 A.Z-堆叠系列的3D投影在细菌释放时表达的结节细胞的图像。乙。在（A）中概述的感染细胞的3D渲染的实例。我知道了，感染细胞;它，感染线程; r，细菌释放; v，液泡。 ?比例尺20μm
  
  视频2.受感染细胞的碎片液泡

笔记

MtSYP22是一种液泡SNARE蛋白，控制前液泡室到液泡运输。 GFP-MtSYP22融合蛋白允许可视化结节细胞中的空泡。 pUB：GFP-MtSYP22融合由在根瘤根（分生组织和感染区）的顶部表达的泛素启动子控制。 pLB：GFP-MtSYP22融合由leghemoglobin启动子驱动，其在根瘤根的固定区的成熟感染细胞中有活性。这些二元载体使得能够基于另外的DsRED1（Discosoma sp。红色荧光蛋白）表达来选择转基因根和结节。
Sinorhizobium meliloti 2011是 M的共生体。 truncatula （可以在Wageningen大学分子生物学实验室获得）

食谱

固定剂
1％多聚甲醛
0.75％戊二醛
50mM磷酸盐缓冲液（Sambrook和Russell，2001）储存于-20°C

致谢

我们感谢我们的同事Norbert de Ruijter帮助共焦成像和T. W. J. Gadella（阿姆斯特丹大学）帮助分析Imaris 3D重建图像。获得博士学位。来自EPS生物科学学院（瓦赫宁根大学）的奖学金。

参考文献

Gavrin，A.，Kaiser，B.N.，Geiger，D.，Tyerman，S.D.，Wen，Z.，Bisseling，T.and Fedorova，E.E。（2014）。调节宿主细胞以适应共生细菌：真菌去功能化，HOPS抑制和TIP1g再定向， em> Medicago 。植物细胞 26（9）：3809-3822。
Limpens，E.，Ramos，J.，Franken，C.，Raz，V.，Compaan，B.，Franssen，H.，Bisseling，T.and Geurts，R。（2004）。 RNA干扰发根农杆菌 - 转化拟南芥根，/em> 55（399）：983-992。
Sambrook，J。和Russell，D.W。（2001）。分子克隆：实验室手册。 Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三??版。