材料和试剂

细胞刮刀（Thermo Fisher Scientific，Nunc ^{TM，目录号：179693）}
MF-Millipore过滤器（Merck Millipore Corporation，目录号：HAWP04700）
细胞培养皿（Greiner Bio One International GmbH，目录号：639160）
Eppendorf管（Corning Inc.，Axygen，目录号：MCT175C）
移液管无菌（25ml）（Greiner Bio One International GmbH）
Falcon管（50ml）（Greiner Bio One International GmbH）
10403S（Daniel Portnoy的实验室产品）（Becavin ，2014）
骨髓（来自C57B/6雌性小鼠;订购自Harlan labs Israel）
液氮
无RNase的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977015）}
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：41965039）
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030081）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11360088）
2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31350010）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270106）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
脑心浸液（BHI）（默克密理博公司，目录号：1104930500）
苯酚饱和（pH 4.3）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1751I-400）
氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1145-1）
异戊醇（Sigma-Aldrich，目录号：W205702）
无水醋酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：W302406）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
DNase I，无RNA酶（与MnCl 2一起提供）（1U /μl）（Fermentas，目录号：EN0521）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0521"。
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4522）
乙醇绝对（Merck Millipore Corporation，目录号：1070174000）
M-CSF（L-929条件培养基）（Englen等人，1995）
注意：或者，M-CSF可购自Sigma（Sigma-Aldrich，目录号：SRP3221）。
BMDM + PS介质（过滤灭菌）（参见配方）
BMDM无PS介质（过滤灭菌）（参见配方）
AE缓冲区（参见配方）
苯酚 - 氯仿-IAA（参见配方）
氯仿-IAA（参见配方）

设备

CO 2强制空气培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：3111）
Kontes玻璃杯（Thermo Fisher Scientific，目录号：K953755-0045）
Speed-Vac浓缩器（Thermo Fisher Scientific，目录号：SPD131DDA）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：G560E）
Nanodrop 1000（Thermo Fisher Scientific）
30℃培养箱（Thermo Fisher Scientific）
65℃加热块（Thermo Fisher Scientific）
4℃台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Eppendorf ^TM，型号：5417R）

程序

感染
第1天：
1. 种子2.0×10 7个骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）用30ml BMDM + PS培养基，每个细菌菌株有3个平板分析。
2. 从BHI板中挑取细菌菌落并接种 ?加入到10ml BHI培养基（每个样品重复）中，在30℃温育孵育，倾斜不摇动过夜。
第2天：
1. 在37℃下预温热BMDM无PS培养基和PBS
2. 用25ml温热的PBS洗涤巨噬细胞单层两次，以除去抗生素。
3. 加入30 ml新鲜培养基。
4. 用PBS洗涤1.5ml过夜的细菌培养物两次。
5. 感染巨噬细胞的MOI为90：1（有利于细菌）野生型。单核细胞增生李斯特氏菌10403S。当突变体缺陷时使用细胞内生长，考虑增加MOI
6. 感染每个板15分钟（与步骤A5相同）。
7. 在0.5小时孵育后（关于每个样品感染时间），用30ml PBS洗涤单层两次。加入30 ml预热的BMDM 无PS介质。
8. 感染后1小时，加入30μl庆大霉素（1：1,000）杀死细胞外细菌
9. 准备过滤装置和冰无RNase水。
10. 感染后6小时，收获细菌。单独处理每个板。
  1. 用PBS洗一次单层。
  2. 加入20ml冰冷的无RNA酶的水。
  3. 使用细胞刮刀，通过推动刮刀前面的液体刮擦和溶解细胞
  4. 通过吸取溶解的单层在50ml锥形管中收集。涡旋30秒。离心2000rpm（720×g/min）/3分钟/4℃
  5. 使上清液通过过滤装置。使用镊子，将滤膜放在15毫升锥形管，松散卷。
  6. 立即通过将15毫升管浸在液氮中冷冻过滤器
  7. 准备下一个样品的过滤器，并重复。
核酸提取
第3天：
1. 制备酸化苯酚：氯仿的1：1混合物，每个样品400μl。在单独的管中混合，然后排出所得的水层吸出。
2. 在冰上解冻含过滤器的管。将每个管完全插入冰中。
3. 向每个含过滤器的管中加入650μlAE缓冲液。向所有试管中加入缓冲液。
4. 工作快，大力涡旋你的过滤器包含管这样过滤器完全搅拌到管的周边和缓冲器 ?在过滤器上洗涤。可能需要额外旋转同时倒置以完全清洗滤器上的细菌。总是将管放回冰上，保持管冷。对所有管重复。它可能可用于在短时间内（1分钟/750rpm/60×g ）旋转悬浮液结束的过程。
5. 转移含细菌的缓冲液到含有40μl10％SDS和400μl的1.5ml Eppendorf管中苯酚/氯仿混合物。对所有管重复。可能需要旋转 ?（1分钟/750转/分钟），得到残留的缓冲液过滤器
6. 将所有的管放在多管涡流装置中，全速涡旋10分钟
7. 孵育管在65℃加热块10分钟。
8. 以最大速度（14,000RPM/20,817×g ）离心5分钟。
9. 将水层（约400μl）从每个管转移到1.5 ml管，含有40μl3M乙酸钠（pH5.2）和1.0ml 100％乙醇。彻底涡旋每根管。
10. 在-80℃1小时孵育样品。
11. 在4℃以最大速度（14,000RPM/20,817×g ）离心20分钟。
12. 小心地从每个管中吸出乙醇。向每个样品中加入500μl冷的70％乙醇，充分涡旋。
13. 在4℃以最高速度离心20分钟
14. 小心地从每个管中吸出乙醇。干燥样品 ?在不加热的速度-Vac装置中约2分钟。它是关键不要过度干燥你的样品
15. 向每个样品，加入25微升无RNA酶的水。在室温下孵育20分钟。小心旋转和旋转。
16. 使用NanoDrop分析样品中的RNA浓度。预期提取约0.5-1μg/板。
17. 您可以在此阶段联合技术重复。
DNase治疗
1. 设置反应：
  
  RNA
  最多2μg（最多44μl）
  
  10x DNase缓冲区
  5微升
  
  H sub 2 O
  完成到50微升
  
  DNase
  1微升
  
  总计
  50微升
2. 在37℃孵育45分钟。
3. 加入450μl无RNase水和500μl苯酚 - 氯仿-IAA混合物， ?通过以最大速度离心2分钟分离各相
4. 将水层转移到新管中，加入500μl氯仿-IAA 混合，涡旋和分离相，最大2分钟离心速度
5. 将水层转移到新管中，加入1ml乙醇和50μl3M乙酸钠（pH5.2）。漩涡
6. 在-80℃下孵育1小时。
7. 在4℃以最高速度离心20分钟
8. 小心地从每个管中吸出乙醇。向每个样品中加入500μl冷的75％乙醇，彻底涡旋。
9. 在4℃以最高速度离心20分钟
10. 小心地从每个管中吸出乙醇。在速度Vac 不加热，干燥样品约2分钟。它是关键不要过度干燥你的样品
11. 加入12微升无RNA酶的水，在室温下孵育2分钟，涡旋和自旋 - 下降。保持RNA在冰上。
12. 使用NanoDrop分析样品中的RNA浓度。预期提取约100 ng /样品。

代表数据

我们提供了诱导毒力基因的代表性数据。单核细胞增生因子在巨噬细胞的细胞内生长期间相比于在BHI培养基中的生长（图1）。在90：1的M.O.I的感染后6小时和在BHI培养基中从细菌生长至中间对数（OD <600 = 0.5），从细胞内细菌纯化mRNA。

图1.在 L生长期间转录 hly 。单核细胞增生李斯特菌在BMDM（6h.p.i.）和BHI实验室培养基中。误差棒代表95％置信区间。结果代表3个重复（N = 3）。 RQ：相对数量

笔记

检查感染细胞感染前后的形态。细胞应该在感染过程中存活。
处理膜时要非常小心 - 使用镊子，只触摸边缘。
当样品通过过滤装置时，首先过滤无RNase的水，以验证真空是否正常，并且系统中没有堵塞。
你应该观察到DNase I处理后核酸浓度的降低。如果你没有观察到减少，考虑另一轮DNase I治疗

食谱

BMDM + PS培养基（过滤灭菌）

DMEM
250 ml

FBS（在54℃灭活30分钟） 100 ml

M-CSF（L-929条件培养基）（Englen等人，1995）
150 ml

谷氨酰胺
5 ml

丙酮酸钠
5 ml

β-巯基乙醇 0.5 ml

Pen/Strep
5 ml
BMDM无PS介质（过滤灭菌）

DMEM
255 ml

FBS（在54℃灭活30分钟） 100 ml

M-CSF（L-929条件培养基）（Englen等人，1995）
150 ml

谷氨酰胺
5 ml

丙酮酸钠
5 ml

β-巯基乙醇 0.5 ml
AE缓冲区
50mM NaOAc（pH 5.2）
10 mM EDTA
无RNase水
4苯酚 - 氯仿-IAA
苯酚25 ml
氯仿24ml
异戊醇1 ml
氯仿-IAA
氯仿24ml
异戊醇1 ml

致谢

该方案改编自以前发表的研究（Lobel等人，2015; Kaplan Zeevi等人，2013; Lobel等人）。，2012）。这项工作由以色列科学基金会和ERA-NET PathoGenoMics（由MOH以色列资助）资助AAH。 L.L是由TAU的阿根廷朋友支持。

参考文献

Becavin，C.，Bouchier，C.，Lechat，P.，Archambaud，C.，Creno，S.，Gouin，E.，Wu，Z.，Kuhbacher，A.，Brisse，S.，Pucciarelli，MG，Garcia Dessel，M.，Hain，T.，Portnoy，DA，Chakraborty，T。，Lecuit，M.，Pizarro-Cerda，J.，Moszer，I.，Bierne，H.and Cossart，。广泛使用的单核细胞增生性李斯特菌株比较EGD，10403S和EGD- e突显了致病性差异的基因组变异。 MBio 5（2）：e00969-00914。
Englen，M.D.，Valdez，Y.E.，Lehnert，N.M.and Lehnert，B.E。（1995）。粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子在鼠L929细胞的培养物中表达和分泌。 J Immunol Methods 184（2）：281-283。
Kaplan Zeevi，M.，Shafir，N.S.，Shaham，S.，Friedman，S.，Sigal，N.，Nir Paz，R.，Boneca，I.G.and Herskovits，A.A。（2013）。单核细胞增生李斯特菌多药耐药转运蛋白和环状二AMP，有助于I型干扰素诱导，在细胞壁应激中起作用。
195（23）：5250-5261。
Lobel，L.，Sigal，N.，Borovok，I.，Belitsky，B.R.，Sonenshein，A.L.和Herskovits，A.A。（2015）。代谢调节剂CodY通过直接激活单核细胞增生李斯特菌来将单核细胞增生李斯特菌代谢与毒力联系起来毒力调节基因prfA。 Mol Microbiol 95（4）：624-644。
Lobel，L.，Sigal，N.，Borovok，I.，Ruppin，E.and Herskovits，A.A。（2012）。整合基因组分析将异亮氨酸和CodY鉴定为单核细胞增生性李斯特菌的毒力。 PLoS Genet 8（9）：e1002887。
Rabinovich，L.，Sigal，N.，Borovok，I.，Nir-Paz，R。和Herskovits，A.A。（2012）。噬菌体切除激活促进噬菌体逃逸和毒力的<李氏李斯特菌能力基因。 Cell 150（4）：792-802。