材料和试剂

Whatman 3MM色谱纸（46×57cm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-714-5）
25ml血清移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-668-2）
DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN，目录号：69504）
蛋白酶K（QIAGEN，目录号：19131或19133）
酶
1. HhaI 20,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0139L）
2. HinF1 10,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0155L）
3. MspI 20,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0106S）
4. HaeIII 10,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0108L）
5. RsaI 10,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0167L）
6. AluI 10,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：R0137L）
7. NE Buffer2 10x浓缩物（New England BioLabs，目录号：B7002S）
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）5,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：M0280S）
Klenow片段（3'→5'外切）5,000单位/ml（New England BioLabs，目录号：M0212S）
DEPC处理水（Life Technologies，目录号：AM9906）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM ，目录号：AM9906"。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Santa Cruz Biotechnology，ChemCruz，目录号：sc-24947）
Tris-Acetate-EDTA（TAE）缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1332-1）
Tris-Base Ultrapure（Research Products International Corp.，目录号：T60040-5000.0）
乙二胺四乙酸（EDTA），二水合二钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP120-1）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
UltraPure TM琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：16500-500）
GelRed核酸染料（PHENIX Research Products，目录号：RGB-4102-1）
放射性标记的TRF标记物（Herbert et al。，2003）
DNA标记（Bionexus，目录号：BN2050）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-10）
氢氧化钠（NaOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
Ficoll-Paque Plus（Thermo Fisher Scientific，目录号：45-001-749）
聚乙烯吡咯烷酮（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40）
牛血清白蛋白（BSA），组分V（Gemini Bio-Products，目录号：700-106P）
dCTP，[α-32 P] -6,000 Ci/mmol 20mCi/ml EasyTide Lead，500μCi（PerkinElmer，目录号：NEG513Z500UC）
20x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15557-036）}
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
10x缓冲液M（Roche Diagnostics，目录号：11417983001）注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：11417983001"。
10x PBS缓冲液 - 磷酸盐缓冲盐水（见配方）
1x TAE缓冲液 - 三醋酸EDTA（见配方）
5x TBE缓冲液 - 三硼酸盐-EDTA（见配方）
杂交溶液（参见配方）
100x Denhardt解决方案（参见配方）
6x甘油和溴酚蓝加载染料（参见配方）

设备

水浴（Thermo Fisher Scientific，型号：Isotemp 205）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，Nanodrop Technologies，型号：ND-1000UV/Vis分光光度计）
凝胶罐（Thermo Fisher Scientific，型号：Owl ^TM A2 Large Gel Systems for 20×25cm凝胶大小）
Savant Slab Gel干燥机（SibGene，型号：SGD4050）
Hybridizer（Bibby Scientific，Techne，型号：Hybrigene）
气缸（Bibby Scientific，Techne，型号：FHB16/FHB15）
热循环仪（LABGENE Scientific，Biometra，型号：T1 Thermoblock）
G-BOX（Syngene，型号：G-BOX F3）
电源（Whatman Biometra，型号：250 EX）
微波炉（GE，型号：1540WW002）
Screen（Molecular Dynamics，型号：Kodak Storage Phosphor Screen）
Typhoon PhosphorImager扫描仪系统（Amersham Biosciences，GE Healthcare，型号：Typhoon TRIO）

软件

图像Quant ^?软件（Molecular Dynamics）
Graph Pad Prism 6 ^?

程序

细胞沉淀：在2ml聚丙烯螺旋盖管中制备细胞沉淀（1×10 6 - 2×10 6/- ）。除去上清液后，可将细胞沉淀在-80℃冷冻注意：优选用1x PBS洗涤细胞沉淀，但不需要此步骤，因为细胞沉淀中的少量培养基不会干扰后续步骤。
细胞裂解：用200μl1×PBS从-80℃重新悬浮新鲜或刚刚在冰上融化的细胞，并加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）。
DNA提取：使用DNeasy血液和组织试剂盒获得高DNA产量。通过Nanodrop定量DNA样品。
注意：有多种方法可以从细胞中提取DNA。我们更喜欢商业试剂盒，因为它可以很容易地进行获得高产量的DNA。

DNA消化：在37℃下用限制性酶（Hha I，EmF 1，Msp ）的组合消化2.5μgDNA 4小时至过夜， I， Hae III， Rsa I， Alu 在dH 2 O中制备2.5μgDNA，使总体积为40μl 加入10μl酶消化混合物到DNA样品（40μl），因此总体积为50μl。在37℃下在水浴或加热块中孵育过夜酶消化混合物：

	1个样品
Hha I	0.25μl
Hinf 1	0.5μl
Msp I	0.25μl
Hae III	0.5μl
Rsa I	0.5μl
Alu I	0.5μl
NE缓冲区2	5.0微升
H sub 2 O	2.5μl
总计：	10微升

凝胶迁移：在样品的任一侧或两侧装载放射性标记的TRF梯和未标记的分子量标记。分离消化的DNA在0.7％（w/v）琼脂糖凝胶上，用凝胶红色（1/20,000x）染色18小时，在70伏下在1×TAE或0.5×TBE缓冲液中的25cm长凝胶。在样品运行后18小时，在UV源（例如在G-BOX）下检查凝胶（例如在G-BOX）。以确保基因组DNA被完全消化并作为低于800bp分子量标记（图1A）。高于800bp的任何物质显示不完全的基因组DNA消化，并且这可能干扰端粒信号（图1B）。

图1.具有DNA梯形标记的凝胶 A. DNA样品以800bp以下的染色条（黄色虚线）运行，显示基因组DNA的完全消化。 B.DNA样品高于800bp（黄色虚线），显示不完全的基因组消化。 bp：碱基对

注意：
1. 向样品中加入5μl负载染料。虽然可以使用0.5x TBE 分析小于?8 kb，可以使用1个TAE缓冲区具有更长的端粒（8至20kb范围）以具有更好的分离。
2. 在大凝胶体系中，400ml体积足以用于0.7％（w/v）琼脂糖凝胶。
3. 放射性标记的TRF标记物可以在杂交后显现端粒序列特异性探针。未标记，消化的质粒DNA 可以用凝胶红可视化，而不是端粒序列特异性探头。
4. 为了防止凝胶从凝胶盘中泄漏：等待20分钟琼脂糖在微波中溶解后。在此期间，密封凝胶托盘和垫圈（凝胶托盘的边缘）之间的空间用5-10ml 琼脂糖凝胶（图2A）。等待30分钟后，凝胶（do 不要忘记当你倒凝胶时放的梳子）。
5. 更高琼脂糖在缓冲液中的浓度将导致样品分离不良 ?和TRF标记（图2B）并且也处理凝胶干燥将采取a 比低浓度的琼脂糖更多的时间。
  
  图2. A。此图显示如何密封垫圈和凝胶托盘之间琼脂糖凝胶以防止泄漏。 B.分离差异 0.7％和1.4％琼脂糖凝胶。而0.7％琼脂糖凝胶显示良好分离在TRF梯度上，在1.4％琼脂糖凝胶上的TRF梯度不能很好地分离。 ?将25μl和12.5μl梯液装载在0.7％和1.4％凝胶的每个泳道中， ?分别。 1.4％凝胶中的TRF梯1和2是相同的梯子。 TRF 梯形单位是千碱基（kb）。
DNA杂交：
1. 在1.5 M NaCl和0.5 M NaOH溶液（pH值）中将凝胶变性20分钟 13.2）在Pyrex容器中（缓慢摇动）。确保变性溶液在摇动期间覆盖凝胶
2. 用MilliQ 水冲洗凝胶以除去NaOH
3. 将凝胶倒置在2张3MM Whatman ^?纸上，并包裹在凝胶的顶部（图3A和B）。
  
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  图3.干燥凝胶的方法（ A和B ）。 Whatman ^?论文位于底部，凝胶位于Whatman 纸之间塑料包装在凝胶的顶部
4. 使用凝胶干燥器（56℃，?3小时）干燥凝胶
5. 将凝胶转移到Pyrex 容器中，用MilliQ 水冲洗并取出Whatman ^?纸。
6. 用0.5M Tris-HCl和1.5M NaCl中和凝胶30分钟溶液（pH 8）。确保中和溶液覆盖凝胶在摇动过程中
7. 将凝胶包裹在25ml移液管上，并将凝胶转移到圆柱形杂交管注意：请确保瓶盖密封良好，不要泄漏。
8. 在杂交炉中在42℃下用10ml杂交溶液预杂交凝胶至少10分钟
9. 加入12.5μl热探针（见下面的步骤7）到新鲜的10ml 杂交溶液，并使其在42℃旋转下杂交过夜杂交炉注意：
  1. 工作时要小心与放射性物质。用盾牌保护自己，尽力避免对工作区域造成任何污染。
  2. 取出热杂交缓冲液并保存备用（可以使用两次，或放入放射性废液中）。
热探针（富C）制备
1. 预退款模板
  3.4μl10pmol/μl（10μM）GTU4寡核苷酸（GTU4引物：5'-GGG UUA GGG UUA GGG UUA GGG AAA-3'）
  15.6μl100pmol /μl（100μM）T3C3 + 9寡核苷酸（T3C3 + 9引物：5'-TTT CCC TAA CCC TAA-3'）
  1μl1M NaCl（50mM终浓度）
  循环程序：
  加热至99℃1分钟
  37℃15分钟
  25℃15分钟
  储存于-20°C
2. 8x调整缓冲区M
  500μl10x缓冲液M/B 100μl2M Tris缓冲液（pH 7.4-7.6）
  25μlBSA（10mg/ml）
3. 反应
  3.125μl8x调整缓冲液M
  1.0μl预退火的模板寡聚体 2.5μldATP（0.5mM） 2.5μldTTP（0.5mM） 9.88μlH 2 O（DEPC）
  5.0μlα-P ³² dCTP
  1.0μlKlenow Exo：
  25℃，30分钟
  98℃5分钟
  25℃，5分钟
  加入0.5μl尿嘧啶DNA糖基化酶1 U /μl（UDG）
  37℃10分钟
  95℃10分钟
  将探针在-20°C下保存不超过2周。
洗涤：在2×SSC，0.1％SDS溶液中在42℃下洗涤凝胶一次15分钟，然后在42℃下在0.5×SSC，0.1％SDS溶液中洗涤凝胶两次15分钟。最后，在42℃下在0.5x SSC，1％SDS中洗涤凝胶两次15分钟。在42℃旋转杂交炉的每个洗涤步骤中可以使用10-15ml洗涤溶液注意：按以下顺序准备洗涤溶液：SSC，水，SDS，以便它们容易溶解。
曝光：准备凝胶进行扫描。简言之，用塑料（Saran型）包装将凝胶包裹在盒中，并将筛子放在凝胶上（图4）。暴露至少4小时，优选过夜。在Typhoon PhosphorImager上扫描屏幕。

图4.说明逐步扫描凝胶的准备工作。准备合适的样品盒尺寸的saran塑料包装，并将其铺展在盒子中。然后，将凝胶放在这个塑料包装上，并用额外的塑料包装包裹凝胶。将屏幕放置在被塑料包裹的凝胶顶部，然后在黑暗的地方孵育。所有步骤应在保护罩后面进行。
计算磷光体成像仪扫描的TRF长度。
通过使用Image Quant</sup>软件和Graph Pad Prism 6 一起描述端粒长度测量。
1. 测量图像定量中每个标记带距离顶部的距离软件（X：测量距离，Y：分子量）（图5A）
2. 在Image Quant软件中（图5B），在样品和背景（空白泳道）周围绘制一个150行的矩形
3. 获取每个样品的每个150箱的强度（体积报告从分析工具给出的强度值）在Image Quant软件。从图像定量到Excel导出体积值。
4. 打开图形垫 Prism并创建一个新的数据和表。检查"Y：输入并绘制单个 ?每个点的Y值"。第一列（X）：测量的距离，秒柱（Y）：分子量。进入分析，分析，XY分析，非线性回归（曲线拟合）并选择一个相位指数衰减。 ?转到选项卡"范围"：检查"创建一个XY坐标表150 定义曲线的点"。 Data1的非线性拟合包含分子 ?Y行中每个距离的权重。
5. 使用创建新页面新数据和表在Graph Pad Prism。检查"Y：输入并绘制单个 ?每个点的Y值"。从中复制背景音量值（强度） ?excel进入第一列，将样品值进入第二列。去分析，分析，双击"变换"。选中"转换Y值" 使用Y = Y-X"。这种等式给出了数据2的变换[新强度 ?（Y）=样品强度（Y） - 背景强度（X）]。去分析，分析，柱分析，双击"列统计"，单击确定。这给出和：Σ（Int ）。
6. 创建包含新数据和的新页面在图垫Prism的表。检查"Y：输入并绘制单个Y值每个点"。将数据1（Y）的非线性拟合复制并粘贴到X列中。将数据2（Y）的转换复制并粘贴到Y列中。去分析，分析，双击"变换"。选中"使用转换Y值" Y = Y/X"。转到分析，分析，列分析，双击"列统计"，点击确定。这给出和：Σ（Int /MW i）。 MW：分子重量
7. 使用以下计算平均端粒长度公式=Σ（Int i）/Σ（Int /MW ）。图5C和D示出了TRF的示例凝胶和一些非小细胞肺癌的平均端粒长度细胞系。
  
  图5.开始步骤图像定量中的端粒长度测量和一些例子非小细胞肺癌细胞系在不同TRF凝胶上。 A.图显示了每个分子量（MW）距离顶部的距离测量图像定量中的基线（红色虚线）。图中显示的列每个样品150行，空行（背景）计算 Image Quant中每个泳道的强度（体积）。 C.HCC15，HCC515和 A549非小细胞肺癌细胞系在不同的TRF凝胶上分子量（MW）标记。 D.HCC15的平均端粒长度， HCC515，A549。梯子大小的单位是千碱基（kb）。

食谱

10x PBS缓冲液 - 磷酸盐缓冲盐水
5L 10x的粉末准备用于制备5L浓缩的10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
准备5 L milliQ 水并加入PBS粉末
接下来加入大搅拌棒，并放置在搅拌器上，直到固体溶解
1x TAE缓冲液 - 三 - 乙酸盐-EDTA
制备2％50x Tris-乙酸盐-EDTA，在milliQ 水中
5x TBE缓冲液 - 三硼酸盐EDTA 在10升MilliQ 水中制备5x储备溶液（pH 8.3）
540克Tris碱
275克硼酸（使用面膜）
200ml 0.5M EDTA（pH 8.0）
加入大搅拌棒，放在搅拌器上，直到固体溶解
杂交溶液
30％（v/v）20x SSC
5％100x Denhardt
2.5％SDS
100x Denhardt溶液
Ficoll 5 g
聚乙烯吡咯烷酮5克
BSA 5g
dH 2 <250ml
6x甘油和溴酚蓝加载染料（50ml）
15ml甘油（30％最终浓度） 125mg溴酚蓝
34ml DEPC H 2 O 2 / ?1ml Tris HCl（pH 7.6）

确认

其中一些方案改编自以前发表的研究（Herbert等人，2003）。我们感谢Zeliha Gunnur Dikmen帮助从UT西南的活细胞成像设备获得TRAP凝胶和Abhijit Bugde，他对端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析的成像和分析部分的帮助。

参考文献

Harley，C.B.，Futcher，A.B.and Greider，C.W。（1990）。人类成纤维细胞衰老期间端粒缩短。自然 em> e 345（6274）：458-460。
Hayflick，L。和Moorhead，P.S.（1961）。人类二倍体细胞株的系列培养 Exp Cell Res < em> 25：585-621。
Herbert，B.S.，Shay，J.W.and Wright，W.E。（2003）。端粒和端粒酶的分析 Curr Protoc Cell Biol 第18章：第18单元16.
Mender，I.和Shay，J.W。（2015a）。端粒功能障碍诱导灶（TIF）分析 B io -prot ocol 5（22）：e1656
Mender，I.和Shay，J. W.（2015b）。端粒酶重复扩增方案（TRAP）生物协议 5（22 ）：e1657。
Olovnikov，A.M。（1973）。边缘切除术的理论。在多核苷酸的酶合成中模板边缘的不完全复制和现象的生物学意义。 41 Theor Biol 41（1）：181-190。
Ouellette，M.M.，Liao，M.，Herbert，B.S.，Johnson，M.，Holt，S.E.，Liss，H.S.，Shay，J.W.and Wright，W.E。（2000）。通过限制端粒酶量使永生化成纤维细胞中的端粒长度。生物Chem 275（14）：10072-10076。
Shay，J.W.and Wright，W.E。（1996）。人类癌症中的端粒酶活性。Curr Opin Oncol 8 （1）：66-71。
Shay，J.W.and Wright，W.E。（2001）。端粒和端粒酶：对癌症和衰老的影响 Radiat Res < em> 155（1 Pt 2）：188-193。
Shay，J.W.，Wright，W.E.and Werbin，H。（1991）。定义人类细胞永生化的分子机制。生物化学生物物理学1072（1）：1-7。