材料和试剂

癌细胞（H1299非小细胞肺，A549非小细胞肺癌细胞）
Tris-HCl（pH 8.3和pH 8.0）
氯化镁（MgCl 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP241）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
Tween TM（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP337）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP-120）
Nonidet-P40（Fluka BioChemika，目录号：74385）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：74385"。
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）（Sigma-Aldrich，目录号：A8456）
dNTP（Invitrogen）
Cy5-TS引物（Sigma-Aldrich）
ACX（反向引物）（Sigma-Aldrich）
TSNT（36-bp内标控制）（Integrated DNA Technologies）
NT（内标用反向引物）（Sigma-Aldrich）
Takara Taq DNA聚合酶，热启动型（Takara Bio Company，ClonTech，目录号：R007A）
40％丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液（19:1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0144）
过硫酸铵（APS）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0700）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
底漆混合物（见配方）
Cy5-TS引物（参见配方）
10x TRAP反应缓冲液（见配方）
50x dNTP（请参阅配方）
NP-40裂解缓冲液（见配方）

设备

聚合酶链反应（PCR）热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：PTC-1148）
Typhoon PhosphorImager 扫描仪系统（Amersham Biosciences，GE Healthcare，型号：Typhoon TRIO）

软件

ImageQuant软件（分子动力学）

程序

准备细胞裂解液
1. 将100,000个细胞收集到DNase/RNase-free微量离心管中
2. 离心细胞在3,000×g离心5分钟。
3. 取出上清液。
  注意：颗粒不需要洗涤。如果要在稍后的时间点使用样品，请放在-80°C。
4. 重悬细胞沉淀在冰冷的NP-40裂解缓冲液中浓度为2,500个细胞/μl（40μl裂解缓冲液为100,000 细胞）。
5. 在冰上放置30分钟或在液氮中快速冷冻细胞裂解物，然后置于-80℃
PCR-Cy5荧光凝胶型TRAP的制备
1. 将样品保存在冰上。
2. 选择阳性对照（即 HCT116，H1299），并在NP-40中制备三种不同的系列稀释液（1:10）。
3. 准备TRAP主混合。 PCR反应的最终体积为50μl 一个样品的主混合：
  
  H sub 2 O
  40.2μl
  
  陷阱缓冲区
  5微升
  
  dNTP
  1微升
  
  Cy5-TS引物
  1微升
  
  底漆混合物
  1微升
  
  BSA
  0.4μl
  
  Taq聚合酶
  0.4μl
4. 将1μl样品加入49μl主混合液中注意：对于阴性对照，1μlNP-40至49μl的主混合物。
通过PCR扩增延伸产物
1. 25℃延伸40分钟。
2. 95℃5分钟以钝化端粒酶。
3. 24到29个周期，在：
  95°C 30秒
  52℃30秒
  72℃45秒
4. 72℃10分钟
5. 4℃，最多5天
  注意：样品可以在-20°C保存1个月。
运行丙烯酰胺凝胶
1. 每个样品加入5μl加载染料
2. 制备10％非变性丙烯酰胺凝胶 32.5ml H 2 O（MilliQ水）
  12.5ml 40％丙烯酰胺（19:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺） 5 ml 5XTBE
  250微升10％APS
  50μlTEMED
3. 0.5x TBE运行缓冲区
4. 在200/220伏下运行时间约为2.5小时。
5. 每孔加入25μl样品。
6. 使用可以读取Cy5荧光素的Typhoon ^?进行可视化
  
  图1.TRAP凝胶显示10μM的部分端粒酶抑制 GRN163L在A549非小细胞肺癌细胞中72小时。已知脂质修饰的N3→P5硫代 - 氨基磷酸酯寡核苷酸， GRN163L（也称为Imetelstat），更多地抑制端粒酶比其亲本非缀合的硫代 - 磷酰胺酯序列有效， ?GRN163，在癌细胞中（Herbert等人，2005）。这个数字也显示 GRN163L（L =用棕榈酰C16脂化）抑制A549细胞更多与GRN163相比。使用H1299非小细胞肺癌细胞 ?用三种不同稀释度作为阳性对照。 2500，250和25 H1299的细胞分别用于泳道1，泳道2和泳道3。没有 ?细胞加入到泳道4中的裂解缓冲液中，泳道4是阴性对照 ?（一个）。 ImageQuant软件用于确定 ?端粒酶产物（6bp梯）和ITAS的强度（内标标准对照，36 bp）条带。强度水平的比率的TRAP样品梯子和ITAS谱带（样品的TRAP强度梯度/ITAS条带的强度），并且每个样品为相对于阳性对照标准化为百分比（阳性对照; H1299 2500个细胞）（B）。

食谱

底漆混合物
引物混合物（50X）包括反向引物（ACX），36-bp内标物对照底物（TSNT）和内标物（NT）或ITAS（内部端粒酶活性标准物）的反向引物。顺序：

库存
最终浓度

ACX
1.0μg/μl
100 ng /μl

NT
1.0μg/μl
100 ng /μl

TSNT
1.0 attomol /μl
0.01 attomol /μl

注意：
1. 强烈建议从其他公司购买TSNT oligo 比购买ACX和NT引物的位置。这有助于防止用ACX和NT污染TSNT。
2. 库存的准备 TSNT应在与TRAP台不同的房间中进行，并使用a 在TRAP区域中未使用的pipetman。
3. < em> attomol是10-18mol。
储备TSNT的准备：
用DEPC处理的水稀释干燥的TSNT寡核苷酸至100μM浓度。然后准备系列稀释液（1：1,000,1：1,000,1：100）; 100nM，100pM和1pM。因此，TSNT原液的最终浓度将包含100x的TSNT原液（1.0attomol /μl）。
注意：要获得正确的ITAS信号，您可以调整TSNT的100x库存量。例如，尝试各种稀释度的100x TSNT样品，如1,000x，300x，100x和30x，并查看ITAS在TRAP梯形图上的外观。

底漆混合物的制备：
1. 将ACX和NT引物与水混合。
2. 移动到准备TSNT的区域，并将TSNT添加到混合物中。
3. 用稀释的漂白剂（喷雾剂）清洁管道和架子的外部 10％漂白剂在管上，然后用纸巾干燥或喷雾10％漂白在纸巾上并清洁管的外侧）
4. 返回到带有管的TRAP区，并准备等分试样在-20°C存储至1年
Cy5-TS引物
TS寡核苷酸购买在5'端用Cy5修饰（HPLC或PAGE纯化）。 TS引物的终浓度为100ng /μl（在DEPC水中稀释）序列：5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3'
10x TRAP反应缓冲液

最终浓度

Tris-HCl（pH 8.3）
200 mM

MgCl 2
15 mM

KCl
630 mM

吐温20
0.5％（v/v）

EGTA
10 mM
50x dNTP
使用含有所有DNA核苷酸（dTTP，dATP，dCTP，dGTP）的混合物，其等效和终浓度为2.5mM

NP-40裂解缓冲液

	最终浓度
Tris-HCl（pH 8.0）	10 mM
MgCl 2	1 mM
EDTA	1 mM
NP-40	1％（v/v）
脱氧胆酸钠	0.25 mM
甘油	10％（v/v）
NaCl	150 mM
2-巯基乙醇	5mM
AEBSF	0.1 mM

确认

其中一些协议改编自以前发表的研究。在此引用了一些TRAP协议（Herbert等人，2003; Norton等人，1998; Wright等人，1995）。我们感谢Zeliha Gunnur Dikmen帮助从UT西南的活细胞成像设备获得TRAP凝胶和Abhijit Bugde，他对端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析的成像和分析部分的帮助。

参考文献

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Herbert，B.S.，Gellert，G.C.，Hochreiter，A.，Pongracz，K.，Wright，W.E.，Zielinska，D.，Chin，A.C.，Harley，C.B.，Shay，J.W.and Gryaznov， GRN163（一种N3'→P5'硫代氨基磷酸酯寡核苷酸）的脂质修饰增强了端粒酶抑制的效力。癌基因24（33）：5262-5268。
Herbert，B.S.，Shay，J.W.and Wright，W.E。（2003）。分析端粒和端粒酶。 Curr Protoc Cell Biol Chapter 18：Unit 18 16.
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Mender，I.和Shay，J. W.（2015b）。端粒限制性片段（TRF）分析 B io- proto col 5（22）：e1658。
Norton，J.C.，Holt，S.E.，Wright，W.E.and Shay，J.W。（1998）。增强人端粒酶活性检测 DNA Cell Biol 17（3）：217-219。
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