材料和试剂

Lab-Tek II室幻灯片（Thomas Scientific，目录号：154461）
癌症或正常人类细胞
Triton-X100（J.T.Baker Chemical Co.，目录号：7-x198）辛基苯酚乙氧基化物（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：X198-07）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Nonidet-P40（Fluka BioChemika，目录号：74385）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：74385"。
鱼明胶封闭缓冲液，10％（Amresco，目录号：M319）
牛血清白蛋白（BSA），组分V（Gemini Bio-Products，目录号：700-106P）
抗磷酸组蛋白H2A.X（Ser139，小鼠）抗体（Merck Millipore Corporation，目录号：05-636）
抗TRF2抗体[EPR3517（Ouellette等人，2000）]（兔）（Abcam，目录号：ab108997）
驴抗兔IgG（H + L）第二抗体，Alexa Fluor 488缀合物（Invitrogen，目录号：A-21206）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Novex ^TM ，目录号：A-21206"
山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗，Alexa Fluor 568缀合物（Invitrogen，目录号：A-11004）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM ，目录号：A-11004"
使用DAPI（Vector Laboratories，目录号：H-1200）的Vectashield 固定介质
Deltavision 浸油N = 1.518（GEHC，件号：290291717）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
MilliQ ^?水
10x PBS缓冲液 - 磷酸盐缓冲盐水（见配方）
1x PBST缓冲区（参见配方）

设备

个人DeltaVision宽场荧光显微镜（GE Healthcare，型号：PD11435）
灯（氙）
相机（Photometrics）
60x/1.42 N.A.（数值孔径）物镜（Olympus）

软件

DeltaVision ^? SoftWoRx软件（GE Healthcare）
Autoquant ^?软件（Media Cyber??netics）
Imaris ^?软件（位面板Imaris）

程序

样品准备
1. 种子细胞在室幻灯片上，孵化他们，直到他们在期望融合（?70％融合）。然而，种子很重要它们很好地分离以分析个体细胞。避免重叠细胞。
  注意：这里描述的量是一个两井室滑动。它可以调整为不同尺寸的腔室滑块。摇晃不需要清洗步骤。
2. 用1ml 1×PBS洗涤细胞5分钟
3. 用4％多聚甲醛（600μl）固定细胞10分钟
4. 用1ml 1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟
5. 在室温下用0.5％Nonidet-P40（600μl）透化细胞10分钟
6. 用1ml 1×PBS洗涤细胞3次，每次5分钟
7. 孵育细胞与封闭溶液（0.2％鱼明胶和0.5％ BSA）（600μl）在室温下30分钟以减少非特异性绑定注意：鱼明胶需要在使用前温热至室温。
8. 孵育细胞与一抗（450微升/孔）稀释封闭溶液在室温下孵育1小时或在4℃过夜 ℃。
  一抗：γ-H2AX：1：1,000稀释
  TRF2：1：250稀释
9. 用1x PBST洗涤细胞3次，每次5分钟
10. 用1x PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
11. 用二级抗体孵育细胞（每份1：500稀释）在封闭溶液中稀释40分钟（450μl/孔）温度
12. 用1ml 1×PBS洗涤细胞6次，每次5分钟
13. 取出载玻片的腔室部分。
14. 用DAPI复染并用指甲油密封载玻片的边缘注意：
  1. 安装介质瓶配有一个螺帽，有一个 ?滴分配器移液器。一滴安装介质，大约相等至25μl，分配在载玻片上，然后盖上盖玻片。
  2. 盖玻片应小心地倒置到一滴安装介质上显微镜载玻片以允许安装介质分散在载玻片上
15. 干燥后可以立即观察载玻片，或者在4°C下长达一个月/-20°C更长时间保存。
16. 在荧光显微镜上的图像。
用荧光显微镜成像
可以使用具有Olympus ^？ 60x/1.42NA物镜的个人DeltaVision ^？宽视场荧光显微镜和Coolsnap sup> 2 相机，图像大小为1,024 x 1,024。为了获得最佳分辨率，请使用60x/1.42 N.A物镜将相机的像素值设置为1 x 1，从而使像素大小为0.1077μm。每个z堆叠之间的光学截面间隔应该大约为0.15μm。至少三个通道可以用TRITC（激发：555/28nm，发射：617/73nm），FITC（激发：490/20nm，发射：528/38nm）和DAPI（激发：360/40nm，发射：457/50nm）滤波器组。选择这些通道中的每一个的曝光，使得其远低于该图像中的最大强度值的4,095的饱和限度。
图像分析
在分析用于两种不同抗体的共定位的图像之前，可以通过使用AutoquantX3软件中的盲去卷积算法去卷积来提高z-堆叠的分辨率。反卷积是一种处理图像的计算方法，其通过使用一系列光学截面（z-堆叠）在显微镜中捕获，以更好的对比度和分辨率。在去卷积过程中，这些系列的光学部分在三维上结合，通过消除显微镜的模糊效应来改善图像质量（Goodwin，2014）。然后，在Imaris ^？软件中应用背景减除滤波器，以在运行共定位分析之前提高图像的质量。对所有图像保持相同的背景减除设置是有用的。
共定位分析
使用Bitplane Imaris执行协同定位分析。背景减除滤波器以提高图像的质量，并且基线减法滤波器从数据中减去估计的基线。在Imaris中选择具有通道1（γ-H 2 AX）和通道2（TRF2）的Coloc算法 2004）。使用通道3（DAPI）选择感兴趣区域（ROI）。 ROI是阈值，允许研究者选择在细胞核内部的信号。由虚线表示的任何信号被认为是背景信号（Costes等人，2004）（图1）。该算法允许根据自动共定位分析计算通道1（γ-H2AX）和通道2（TRF2）的阈值，从而消除用户偏差。在两个通道的自动阈值化之后，在coloc分析算法中使用"Build Coloc Channel"按钮构建新的coloc通道，通道4。在为每个核（通道3，DAPI）创建表面之后，在Imaris 中使用Spot函数来产生通道1（gamma-H2AX），通道2（TRF2）和通道4 （coloc）。为了在前一步骤中产生新斑点，我们通常选择0.2微米作为斑点的直径。先前为通道3（DAPI）创建的表面被选择为ROI，并且应用分裂点到表面对象函数（其是Imaris中的matlab扩展）来生成新点。使用上述步骤，单独计算每个核中每种蛋白质的斑点数

图1.这是示出2D直方图和定义感兴趣区域（ROI）函数的示例图。使用通道3（DAPI）的ROI被阈值化，使得由虚线表示的核外部的信号线不用于共定位分析计算。此图片不反映实际生物学，仅用于说明目的
在imaris软件中进行colocalization分析的步骤

食谱

10x PBS缓冲液 - 磷酸盐缓冲盐水
5L 10x的粉末准备用于制备5L浓缩的10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
准备5 L milliQ 水和PBS粉末在其中
然后加入大量搅拌棒，并置于搅拌器上，直到固体溶解
1x PBST缓冲区
1x含0.1％Triton的PBS

确认

其中一些协议改编自以前发表的研究。我们感谢Zeliha Gunnur Dikmen帮助从UT西南的活细胞成像设备获得TRAP凝胶和Abhijit Bugde，他对端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析的成像和分析部分的帮助。

参考文献

Costes，S.V.，Daelemans，D.，Cho，E.H.，Dobbin，Z.，Pavlakis，G.and Lockett，S。（2004）。自动定量测量活细胞中的蛋白质 - 蛋白质共定位。 J 86（6）：3993-4003。
de Lange，T。（2002）。保护哺乳动物端粒。癌基因 21（4）：532-540。
de Lange，T。（2005）。 Shelterin：形成并保护人类端粒的蛋白质复合物。 Genes Dev 19（18）：2100-2110
Goodwin，P.C。（2014）。 Quantitative deconvolution microscopy。 Methods Cell Biol 123：177 -192。
Karlseder，J.，Broccoli，D.，Dai，Y.，Hardy，S。和de Lange，T。（1999）。缺乏TRF2的端粒诱导的p53和ATM依赖性凋亡。科学 283（5406）：1321-1325。
Mender，I.和Shay，J.W。（2015a）。端粒酶重复扩增方案（TRAP）生物协议 5（22 ）：e1657。
Mender，I.和Shay，J. W.（2015b）。端粒限制性片段（TRF）分析生物协议 5（22 ）：e1658。
Takai，H.，Smogorzewska，A.and de Lange，T。（2003）。 DNA损伤聚焦于功能障碍的端粒。 Curr Biol 13 （17）：1549-1556。