材料和试剂

0.5ml K 2 -EDTA收集管（BD，目录号：363706）
无菌注射器和30号针头（Thermo Fisher Scientific，目录号：10142534）
5英寸方形铝箔
不可消失的记号笔（黑色） - 尖锐的细尖
巴斯德移液器
柳叶刀（MEDIpoint，Inc.，型号：Goldenrod5mm）
携带肿瘤异种移植物的小鼠
注意：免疫受损小鼠的株系取决于植入物的类型。年轻NOD/SCIDγ（NSG）小鼠特别有利于患者来源的异种移植（PDX）模型。
如果需要，用氯胺酮麻醉，表III控制物质（Sigma-Aldrich，目录号：K2753）
Tracer [例如 ¹³ 6 < - >葡萄糖，¹³ 2 < 2-葡萄糖（60mg /小鼠）或者13 C 15 S - 15 N - 谷氨酰胺（22） mg /小鼠）]
来源
1. （Cambridge Isotope Laboratories，Inc。，目录号：CLM-1396-CTM）。< br />
2. （Cambridge Isotope Laboratories，Inc。，目录号：CLM-504），其中所述抗体包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3. （Cambridge Isotope Laboratories，Inc。，目录编号：12），其包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO： CNLM-1275）
或
1. D-葡萄糖 - 13 C（Sigma-Aldrich，目录号：660663）
2. D-葡萄糖-1,2-二醇（Sigma-Aldrich，目录号：661422）
3. （Sigma-Aldrich，目录号：607983）中的L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺的混合物，
液氮
70％乙醇
10％中性缓冲福尔马林（Thermo Fisher Scientific，Protocol ^TM，目录号：032-059）
在PBS中的25％w/v无菌过滤（0.2μm）13 C葡萄糖注意：储备液可以冷冻保存在-25°C。
无菌抹布（Uline，目录号：S-16183）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-1）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S-0876）
无水磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
0.2％的13 C 6 - 葡萄糖的储备溶液（参见配方）
（10毫升）的储备溶液（见Recipes）
/>

设备

鼠标约束系统（Plas-Labs，Inc.，型号：541-RR）
用于小鼠和大鼠的第一手术器械套件（Kent Scientific Corporation，型号：INSMOUSEKIT）
蓝蜡清除盘（VWR International，目录号：10060-188）
加温毯（Kent Scientific Corporation，型号：DCT-15）
使用去离子水（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-897-11）的水瓶
聚苯乙烯称重船（USA Scientific Inc.，目录号：2347-1427）
用于测量肿瘤尺寸的卡尺（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-077-957）
用于称量组织的2位天平（VWR International，Adventurer Ohaus ^?，目录号：10153-744）
冷藏微量离心机（Eppendorf，型号：5417R带转子）
用于LN2（Thermo Fisher Scientific，目录号：S34074C）的杜瓦瓶/桶（Nalgene plastic杜瓦尔）
大型发泡胶盒

程序

所有实验必须在IACUC批准的方案下进行。对于人体组织异种移植物，还必须满足适当的IRB批准。

排定
1. 允许小鼠中的肿瘤发育至至少0.5cm和至多1.5cm 根据异位移植或原位异种移植的具体方案细胞或新鲜组织（PDX模型）以及其他肿瘤模型（例如转基因肿瘤模型）。
2. 准备
  稳定同位素分析代谢组学（SIRM）实验前一天：
  1. 带有日期，小鼠数量和组织（例如肿瘤）和采血管（每只小鼠2只，用于收集）的预标记Al方块在示踪剂注射后立即和在尸体剖检时）日期，鼠标数量，收集时间。
  2. -80°C冰箱的标签储存盒。
  3. 制备示踪剂溶液例如 25％^{13 - 葡萄糖（1.344 M）或36.2 在无菌PBS，无菌过滤器中的0.1mg/ml的13 C 15 S，15 S/N 2 -Gln（0.2M），并存储以等分试样， -20℃。}
  4. 标签福尔马林瓶与日期，鼠标数量和肿瘤来源。
  5. 将所有组件装在可密封的盒子中进行运输
  6. 准备计划表（见下面的例子，表1）。
3. 示踪剂注射
  当小鼠准备好时，将小鼠限制在小鼠限制器中，使用无菌擦拭物对尾静脉的注射区域进行灭菌。通过尾静脉注入稳定同位素示踪剂（或其他方便 ?静脉，例如下颌下静脉）植入个体固定化的小鼠中。将鼠标放在保暖毯子上或轻轻加热尾部明显扩张静脉，使注射更容易。
  1. 记录注射时间。
  2. 立即取血样（见下面的步骤5）。
  3. 对于13 C 16 - 葡萄糖（可购自Sigma Isotec或Cambridge 同位素实验室，参见上文）：每次注射80μl（20mg）25％（w/v）储备溶液（在PBS和0.2μm无菌过滤），间隔15分钟 ?次（总计=322μmol）。
  4. 对于¹³ C 5 ，¹⁵ N <2> -Gln：除了注射200μl（7.2mg）各36.2mg/ml储备溶液（in PBS和0.2μm无菌过滤）以15分钟间隔3次（总数= 142 μmol）。
  5. 大剂量注射需要几秒钟。极端高心率（500-600次/分钟，静息成人小鼠）确保示踪剂系统地非常快速地分布，因此近似一个脉冲。
    注意：*我们尝试注射到氯胺酮麻醉的小鼠。由于麻醉减缓了新陈代谢，所以时间必须加长。麻醉也可以改变代谢。使用物理约束方法，重要的是在注射过程中使受约束的小鼠的应力最小化。黑色小鼠更难以通过尾静脉注射。重复进行定时注射的能力需要相当多的实践。
4. 组织收获
  1. 在第一次注射后45分钟（最后一次注射后15分钟），拍摄小鼠和肿瘤的照片
  2. 在通过颈椎脱位杀死小鼠前取血样（do 不使用CO 2窒息或致死性注射巴比妥类药物干扰新陈代谢）
  3. 使用卡尺测量肿瘤大小（图1）
  4. 解剖相关组织，例如肿瘤，肺，肝，心脏，肾脏，脑，骨骼肌，脂肪，下肠和快速冷冻组织立即（在尸检5分钟内）在液体N 2中，然后放置 ?冷冻组织在预平衡的螺旋盖2ml微量离心管中液体N 2或在铝箔（制成船形）上漂浮液体N 2，随后包裹**。
    注意：**使用不可擦除（耐溶剂）永久性墨水清洁笔用于标记样品管或铝箔，以避免标签被冲洗。
  5. 解剖的顺序是主要由感兴趣的主要器官决定，应当移除如果可能的话。在冷PBS中简单冲洗解剖组织，在安乐死的2-6分钟内在液体N 2中吸干和快速冷冻
  6. 肿瘤应该在冷的PBS中冲洗，吸干和称重，然后在1NN 2（图1）中快速冷冻并拍照。
  7. 这项工作通常需要至少三个人。
  8. 多次注射，实际上做三个小鼠作为一组，定时注射相隔5分钟。
    
    图1.小鼠尸检。 A.植入肿瘤的NSG小鼠。测量 ?尺寸使用电子卡尺B.解剖显示异位肿瘤。血液管在橙色架; C.肿瘤片后称重印迹
5. 血样处理
  1. 应立即收集血液至K 2 EDTA-EDTA微管['紫色 ?顶部"]（为小鼠设计）在示踪剂注射（1次）之后和之前到尸检（第2次）。
  2. 初始采血量不应超过150μl;收集尽可能多的血液为2 ^nd集合。
  3. 让血液在室温下放置5分钟，然后储存在冰上。
  4. 在4℃下将血液以3500xg离心15分钟。
  5. 将血浆与血细胞分离并快速冷冻液体N 2中的分离的组分。
注意：
1. EDTA抗凝剂优于柠檬酸盐，肝素等，因为EDTA对新陈代谢的影响最小。
2. 我们通过眶内或通过下颌下静脉收集血液使用通常优选的柳叶刀（Golde等人，2005）;其他方法可以适用（例如从其他静脉）并且在牺牲时，心脏冲洗以最大限度收集血液。
3. ****很重要保持血液在RT 5分钟以减少溶血，但将血液储存在冰上 ?之后直到离心。
4. 所有样品都储存在-80°C或更冷的地方。
5. 如有必要，分析样品应在干冰上过夜运输。
6. 根据组织和血液提取代谢物建立方案，然后通过高分辨率NMR，GC-MS，和FT-ICR-MS不仅确定代谢物的含量，而且确定 ?它们的标记同位素和同位素分布代表从源示踪剂到代谢转化观察到的注射和尸检之间的间隔代谢产物（Fan ?et al。，2011; Fan，2012a; Fan等人，2012; Lane et al。，2011）。

代表数据

已经从这些实验在可比较的时间点获得了各个器官的定性相似的13 C代谢物概况，如从1-D sup-1 > C} -HSQC光谱（例如图2）（Fan等人，2011; Yuneva等人，2012; Sellers > et al。，2015; Xie et al。，2014）。每个代谢物中每mg的^{13 C的量可以从乳酸盐甲基共振的强度计算，与通过1 H NMR或GC-MS独立测定的其浓度相比较。这些方法还提供每种可观察到的代谢物的部分富集，如Lane等人（2008）中所述。 Fan等人（2011）和Lane 等人（2008）提供了数据简化和分析的详细说明。

图2.注射了13 C标记的NSG小鼠的不同器官的1D图像1 H C C 6葡萄糖。 NSG小鼠通过尾静脉注射以15分钟的间隔接受三次20mg的每个<13 C 6葡萄糖。在尸检5分钟内解剖心脏，肾脏，肝脏，脑和肺组织，快速冷冻于液体。 N 2粉末。并且对于如所述的极性代谢物用乙腈：H 2 O:CHCl 3（4:3:2v/v）萃取（10）。将NMR光谱归一化为提取物的残余干残余重量。在制备NMR样品之前将提取物冻干，如（Fan，2012b）所述
表1.示例记录表
标题：
日期：
实验：将来自患者＃（日期）的肿瘤植入2个NSG小鼠（研究者名称）。
2只小鼠，每片subQ植入两侧腹部
小鼠1F肿瘤大小= 耳标＃
小鼠2 M肿瘤大小=耳标＃
SIRM /收获日期
处理：3×80μl25％13 C 16 - 葡萄糖尾静脉15分钟间隔（M1）或3×200μl，36mg/ml < （M2）中的一个或多个来形成。
麻醉Y/N 依次提取器官：
血液，肿瘤，肺，心脏，肝，肾，脑...}

时间	处理	时间后注射/分钟	评论
M1	80μlGlc	0
	血
	80μlGlc
	80μlGlc
	血液
	囊
	肿瘤		质量：g
	龙
	心脏
	肝脏
	肾
	大脑

M2	200μlGln	0
	血
	200μlGln
	200μlGln
	血液
	囊
	肿瘤		质量：g
	龙
	心脏
	肝脏
	肾
	大脑

将样品放入福尔马林进行病理学。将小样品放入培养基中用于在NSG小鼠中进一步繁殖和用于细胞培养。

笔记

注射可以用约束实现，其受到应激激素释放的影响。或者，可以用氯胺酮麻醉小鼠，其可以减缓一般代谢，同时它们无意识并且由于麻醉剂的非预期的作用而改变某些代谢途径。
黑色小鼠的尾静脉注射可能是具有挑战性的。替代方案是腹膜内注射（其具有不同的时间过程），通过颈静脉或颈动脉进食或直接输注（de Graaf等人，2011）（http://jaxmice.jax.org/preconditioned/surgical/pricing.html ）。

对于异种移植物，可获得多种免疫受损菌株，其可根据研究设计使用（ http： //jaxmice.jax.org/findmice/index.html ）。可在注射建立的癌细胞（Fan等人，2011; Lane等人，2011），原代细胞系和新鲜肿瘤组织（PDX）后形成异种移植物模型）（Sellers等人，2015），皮下或原位。所需的组织量和细胞数量很大程度上取决于肿瘤或细胞系特征的来源

血液分析对于监测递送的示踪剂的量和实验期间的总体利用是至关重要的。实验的瞬时性质提供关于在短标记时间段期间操作的途径的信息和不同组织的摄取和利用的相对速率。这可以通过对在注射后不同时间收获的一组小鼠的时间过程分析来改进。不同数量的注射也可以用于延长或降低不同代谢物组中的标记程度。在注射了13 C - 葡萄糖的小鼠中的血液代谢物时程的实例在Fan等人（2011）。

通过推注，不能达到同位素稳定状态（de Graaf等人，2011; Maher等人，2012），并且具有缓慢更新的代谢物不会变得显着标记。为了标记这些代谢物，可以使用通过适当的静脉较长时间的连续输注（Marin-Valencia等人，2012）或更长期的示踪物喂养。

由于小鼠年龄，处理和肿瘤状态的一些变异性，使来自不同个体的代谢物值平均可能不实用。根据效果大小，需要5只或更多的小鼠/组。优选地，应当使用所有相同的性别，并且任何可能的同窝幼仔。使用PDX模型，我们通常将小鼠性别与肿瘤捐赠者的性别相匹配

食谱

10x PBS
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4无水
2.4g KH 2 PO 4水溶液
溶于950ml 18Mohm水中，pH至7.4，换至1L，无菌过滤器（0.2μm）
lt; 13> 6 6 - 葡萄糖（10ml）的储备溶液。
2.5g 13 C - 葡萄糖
1x PBS至总共10ml ml
无菌过滤器（0.2 mm）装入无菌螺帽容器
储存在-4°C
用于¹³，¹⁵ N 2 -Gln（10ml）的储液。
0.362g ^{13 ，¹⁵ N <2> -Gln
1x PBS至总共10ml ml
无菌过滤器（0.2毫米）1毫升等分到无菌螺帽小瓶
储存于-80°C
注意：应将谷氨酰胺储备液制成新鲜或在-20°C下小份储存，以避免反复冻融。它在中性pH和更高温度下在溶液中储存形成焦谷氨酸。}

致谢

该方案从以前发表的研究中修改（Fan et al。，2011）。该工作已由NIH Grants 1R01CA118434-01A2，NIH 5R01ES022191-04，NIH 3R01ES022191-04S1（至TWMF），R01CA-086412和RO1 CA150947（至JY），NIH R21CA133688（至ANL），NIH P01 CA163223（至ANL ，TWMF和JY），以及NIH 1U24DK097215-01A1（TWMF，ANL），肯塔基挑战挑战赛和Susan G.Komen基金会BCTR0503648。

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