材料和试剂

常用的医用棉纱布
0.2 ml管
注意：在热带鱼商店购买20-30cm长的Vallisneria的幼苗，并培养以在填充有自来水和底部的一层土壤的桶（20L）中生长超过100cm （图1A）。植物在12-24小时光照/12小时黑暗条件下在20-24℃生长。
葡聚糖（来自Leuconostoc ssp。，Mr?500,000）（Fluka，目录号：31392）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：31392"。
聚乙二醇（Sigma-Aldrich，目录号：P-3640）
SDS- PAGE
去离子水
1％Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-9284）
50mM MOPS-KOH（pH7.6）（DOJINDO，目录号：343-01805）
300mM蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：196-00015）
10mM乙二醇双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'， - 四乙酸（EGTA）（DOJINDO，目录号：342-01314）
5mM乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
10μg/ml二丁基羟基甲苯（Tokyo Chemical Industry，目录号：D0228）
1％酪蛋白（Nacalai tesque，目录号：073-19）
5mM K 2 SS 2 O 5（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：161-03345）。< br /
1mM二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：048-29224）
2.5mg/ml胃蛋白酶抑制剂A（Sigma-Aldrich，目录号：P-4265）
2.5mg/ml抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A-4529）
20mg/ml EDTA洗涤的聚乙烯聚吡咯烷酮（Sigma-Aldrich，目录号：P-6755）
MOPS-KOH（DOJINDO，目录号：345-02225）
25mM MgCl 2（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：135-00165）
250mM KCl（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：163-03545）
40％甘油（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：075-00616）
20％2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：A-6365）
少量溴酚蓝（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：021-02911）
0.5M Tris-HCl（pH6.8）（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
均质介质（见配方）
缓冲区A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）
5x磷酸化缓冲液（参见配方）
ATP混合物（参见配方）
4x SDS缓冲液（参见配方）

设备

Blade（Lion Office Products Corp.，型号：L-300）
Polytron匀浆器（Kinematica AG，型号：PT-35/2ST"OD"）
离心机
超速离心机
Teflon匀浆器（10ml）（Ikemoto Scientific Technology，型号：812fect04）
照明系统（Sugiura Lab，型号：FI-150T）
截止滤光器（Kenko Tokina Corporation，型号：Y-44）
干涉滤光器（Kenko Tokina Corporation，型号：BP-45）
放射自显影（富士胶片公司）

程序

植物材料和标本的预处理
在热带鱼店购买长度为20-30cm的长春花属的年轻植物，并培养以在盛有自来水的桶（20L）中生长超过100cm，并且在其上铺有一层土壤底部（图1A）。植物在12-24小时光照/12小时黑暗条件下在20-24℃生长。光源是一组20W荧光灯（50μmolm-2s -1 ）。
制备粗微粒体（CM）级分和富含质膜的（PM）级分
1. 在光照期结束时，40g的健康新鲜叶收获到自来水中并保持在完全黑暗中12-16小时。
  注意：使用前，从叶子上剪掉不健康的部分。
2. 用刀片将叶子在冰上切碎（图1B）。这些小叶片用Polytron匀浆器（图1C）匀浆 120ml匀浆培养基。
3. 将匀浆通过六片纱布（图1D）过滤并离心（8,000×g，15分钟，4℃）。
4. 将上清液（图1E）在156,000×g下在4℃超速离心1小时。
5. 用Teflon匀浆器将沉淀悬浮在缓冲液B中（图1） 1F），然后在4℃下以156,000xg再次超速离心1小时 ?C。
6. 用缓冲液A洗涤沉淀（图1G），然后重悬于小体积（通常6ml）的新鲜缓冲液A中，指定为CM分数。当直接使用CM部分时磷酸化测定，洗涤并用缓冲液B悬浮，而不是缓冲区A.
7. 从CM中分离出高度纯化的PM级分通过应用水性聚合物两相分配（图 1H-1）使用来自明串珠菌（Leuconostoc ssp。约500,000和聚乙烯乙二醇（Yoshida等人，1983; Takagi等人，1988; Harada等人，2002）。
8. 最后超速离心后富含聚乙二醇的上层相，将沉淀物洗涤缓冲液B，然后重新悬浮在小体积的新鲜缓冲液中，指定为PM分数注意：所有的程序都进行在0-4℃下在暗红光（0.1μmolm -2 s -1 s -1 -1）下在冰上进行。总数通过Bradford测定CM和PM级分中的蛋白质含量测定。将CM和PM级分在冰上保存在黑暗中直到使用。
图1. CM和PM级分的制备步骤。 Vallisneria B.将叶子在冰上切碎。 C.将叶子用Polytron匀浆器进一步匀浆。 D.将匀浆通过六片纱布过滤。 E.在低速离心（8,000×g，15分钟）之前过滤匀浆以除去碎屑，??例如细胞壁。 F.用Teflon匀浆器将第一次超速离心（156,000×g，1小时）后的沉淀物悬浮。 G.第二次超速离心后的沉淀（156,000×g，1小时）。 H和I.在第一（H）和第二（I）两相分配后，将富含质膜的上层相与下层相分离。

体外磷酸化测定

如下所述将CM和PM部分悬浮在反应混合物中反应混合物（每个反应17.5μl）

CM和PM级分含有20μg蛋白质	x微博
5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液5x磷酸化缓冲液	4微升
1％Triton X-100 ;	1微升
去离子水 ;	17.5-x微克

将放入0.2ml管中的反应混合物用蓝色照射光（450nm）照射规定的时间（通常为0-300秒），使用a 照明系统，配有光纤适配器，截止滤波器和干扰滤波器（图2A）。
紧接着结束后 ?照射，将反应混合物与ATP混合物（2.5μl）并孵育2分钟以允许磷酸化反应。通过加入终止反应 ?4×SDS缓冲液（7μl）注意：步骤C1-3在冰下进行 ?暗红光（0.1μmolm-2 s-1）在黑暗的房间，以避免任何通过背景光的非特异性激发光感受器。
将样品煮沸2分钟，并在10.0％SDS中进行SDS-PAGE，（w/v）凝胶。凝胶上的分离的多肽被染色一次考马斯亮蓝可视化蛋白质谱（图2B，左面板）。
注意：在每个泳道中，加载了20μg蛋白质。
通过暴露脱色和干燥进行放射自显影 ?凝胶到成像板在室温下0.5-1小时（图2B，右面板）。

图2.照射和放射自显影。 A.使用照明在冰上在0.2ml管中照射样品系统配有光纤适配器，截止滤波器和干扰 ?过滤。 B.用考马斯亮蓝染色的干燥凝胶（CBB; 左图）和其放射自显影图（右图）。之前（D）和 ?在（L）光化辐照后，蛋白质磷酸化水平在粗微粒体级分（CM）和a 质膜富集级分（PM）。 M;分子大小标记，箭头; Vallisneria的光致磷酸化的放射性信号。

食谱

均质介质
50mM MOPS-KOH（pH7.6） 300mM蔗糖 10mM乙二醇双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'， - 四乙酸（EGTA）
5mM乙二胺四乙酸（EDTA） 10μg/ml二丁基羟基甲苯 1％酪蛋白
5mM K 2 subS 2 O 5 sub/2 1mM二硫苏糖醇（DTT） 2.5mg/ml胃酶抑素A
2.5mg/ml抑肽酶
20mg/ml EDTA洗涤的聚乙烯吡咯烷酮注意：使用磁力搅拌器将介质的内容物在4℃下混合过夜（12-16小时），除了K 2 subS 2 O 2外， 5，DTT，胃蛋白酶抑制剂A，抑肽酶和EDTA洗涤的聚乙烯基吡咯烷酮，其在使用前立即加入。预先用5-mM EDTA洗涤聚乙烯吡咯烷酮，用滤纸过滤，并在滤纸上在室温下干燥1-2天。
缓冲区A
10mM K-磷酸（pH7.8） 250mM蔗糖
缓冲区B
5mM MOPS-KOH（pH7.6） 250mM蔗糖 0.1 mM DTT
5x磷酸化缓冲液
250mM Mops-KOH（pH7.0） 25mM MgCl 2·h/v 250 mM KCl
5 mM DTT
ATP混合物（每个反应2.5μl） 10mCi/ml [μ-γ-32P] ATP0.5μl
20μMATP2μl
4x SDS缓冲液
8％十二烷基硫酸钠（SDS）
40％甘油 20％的2-巯基乙醇少量溴酚蓝
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）

致谢

该协议从Takagi等人（1988）和Harada等人（2002）的先前工作修改。我们感谢Motoyuki Iida先生拍摄了Vallisneria植物的培养设施（图1A）。

参考文献

Christie，J.M。（2007）。 Phototropin蓝光受体 Annu Rev植物生物 58：21-45。
Harada，A.，Okazaki，Y。和Takagi，S。（2002）。 Vallisneria叶片中细胞膜H + -ATPase的光合控制。 I.在光诱导的膜超极化期间的活性调节。 214（6）：863-869。
Inoue，S.，Takemiya，A。和Shimazaki，K。（2010）。光催化信号传导和气孔开放作为模型案例。Curr Opin Plant Biol 13（5）：587-593。
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Sakai，Y.，Inoue，S.，Harada，A.，Shimazaki，K.and Takagi，S。（2015）。蓝光诱导的Vallisneria中的快速叶绿体解旋表皮细胞。 Integral Plant Biol 57（1）：93-105。
Sakamoto，K。和Briggs，W.R。（2002）。光托品1的细胞和亚细胞定位。植物细胞 14（8）：1723-1735。
Seitz K（1987）Light-dependent movement of chloroplsts in higher plant cell。 ACTA PHYSIOLOGIAE PLANTARUM 9：137-148
Senn，G.（1908）。 Die Gestalts- undLagever?nderungder Pflanzen-Chromatophoren。（位于德国）。
Takagi，S.，Yoshida，S。和Nagai，R。（1988）。使用Vallisneria叶的细胞膜成孔的模型。方法在bryology。 Proc Bryol Meth ，81-88。
Takagi，S。（1997）。细胞质流的光调节：信号转导途径的细胞生物学分离。植物研究。 110：299-303。
Yoshida，S.，Uemura，M.，Niki，T.，Sakai，A.and Gusta，L.V。（1983）。在水性双聚合物相系统中分离膜颗粒及其实际用于纯化质膜的方法植物。植物生理学 72（1）：105-114。