材料和试剂

Oak Ridge离心管（Thermo Fisher Scientific，Nalgenetm TM，目录号：3118-0050）
Miracloth（EMD Millipore Corporation，目录号：475855-1R）
酿酒酵母菌株XK1-25：MATa trp1（由Dr. Jin-Rong Xu博士和普渡大学植物病理学部提供）
pHZ126酵母穿梭载体（由Dr. Jin-Rong Xu博士和美国普渡大学植物病理学部提供）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
碱性阳离子酵母转化试剂盒（MP Biomedicals，目录号：2200-200）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
UltraClean Midi Prep试剂盒（MO BIO Laboratories，目录号：12700-20）
Zymoprep Yeast Plasmid Mini Prep II Kit（Epigenetics，目录号：D2004）
甲醛（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^{TM，目录号：28906）}
DSG（Thermo Fisher Scientific，目录号：20593）
CelLytic PN植物核分离试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：CELLYTPN1）
核分离缓冲液（NIB）（包含在CelLytic TM supper PN植物核分离试剂盒中）
Triton X-100溶液（10％，在H 2 O中）（MBL International，目录号：JM-2104-100）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8215）
脱氧胆酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
丁酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：B5887）
Sepharose 4B珠（Sigma-Aldrich，目录号：CL4B200）
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
抗IgG琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A0919）
3x FLAG 肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
甘氨酸（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15527-013）}
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0491）
RNase A（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
Wizard PCR Clean-up试剂盒（Promega Corporation，目录号：A9281）
无氨基酸的酵母氮源（Difco，目录号：0919-15）
Trp DO supplement（Clontech，目录号：630413）
戊二酸二琥珀酰亚胺酯（DSG）（Thermo Fisher Scientific，目录号：20593）
来自哈茨木霉的裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L1412）
潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10-687-010）
SD-Trp固体培养基（参见配方）
SD-Trp液体溶液（参见配方）
补充有100μg/ml氨苄青霉素（参见Recipes）的LB琼脂平板
液体完全培养基（见配方）
DSG交联缓冲液（参见配方）
1x NIB（请参阅配方）
NIBA（请参阅食谱）
核裂解缓冲液（见配方）
HEPES缓冲盐水（HBS）（参见配方）
0.1 M甘氨酸HCl（pH 3.5）（参见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
OM缓冲区（参见配方）
ST缓冲区（参见配方）
STC缓冲区（请参阅配方）
PTC缓冲区（参见配方）
底部介质（参见配方）
顶级媒介（见配方）

设备

台式振荡器（Eppendorf，目录号：M1354-0000）
VirTis VirSonic 50超声波细胞破碎仪（VirTis公司）
离心机（Eppendorf，型号：5415D）
微型管旋转器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：05-450-127）

程序

在 M中进行ChIP分析的第一步。 oryzae 是构建表达与来自其天然启动子的3x FLAG融合的靶基因的质粒。我们常规使用Zhou等人（2011）描述的酵母穿梭载体和方法，概述如下：
1. 矢量准备。
  酵母穿梭载体，pHZ126（Zhou等人， 2011），可用于产生C末端3x FLAG融合构建体。 ?除了3x FLAG编码序列之外，pHZ126携带TRP1 在用于在大肠杆菌（大肠杆菌）菌株中选择的酵母Trp ^-菌株中选择Amp 基于潮霉素抗性的HygR选择 ?in M。 oryzae 。在准备亚克隆靶基因时， pHZ126载体DNA通过用XhoI消化和在大小后线性化在0.8％琼脂糖凝胶上确认，用QIAquick凝胶纯化提取试剂盒，按照制造商的协议。
2. 靶基因扩增
  1. 以下引物对用于产生靶基因PCR 产物具有重叠序列用于与3xFLAG框内融合编码序列在pHZ126穿梭载体上进行（Zhou等人， 2011）：
    Gene-fw：5'-TATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTT XXXXXXXXXXX -3'
    Gene-rv：5'-TTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTC YYY YYYYYYYY -3'
    注意：带下划线的核苷酸序列是靶标特异性的基因。非下划线序列用于同源重组 ?到酵母穿梭载体pHZ126上。为了生成帧内在pHZ126上靶基因和3xFLAG标签序列之间的基因融合，引物Gene-rv中的斜体字的核苷酸序列编码目的基因终止密码子前的最后一个密码子。为了获得最佳结果，该基因 ?特异性序列设计为具有65℃的熔解温度， ?理想的GC含量为40-60％，和35-40个循环的PCR反应应该 ?
  2. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒，按照制造商的方案凝胶纯化靶基因扩增子。
3. 将来自步骤A2的靶基因PCR产物通过共转化到酵母中亚克隆到XhoI消化的酵母穿梭载体pHZ126上 ?菌株XK1-25，按照碱性阳离子酵母的方案转化试剂盒。
  注意：未加下划线的核苷酸序列添加到上述Gene-fw和Gene-rv引物上方便于重组通过与XhoI的任一侧上的载体序列比对而在pHZ126上 ?限制性位点。因此，PCR产物不需要消化与XhoI。
  筛选携带靶的酵母转化体在含有SD-Trp的平板上进行pHZ126中的基因-3x FLAG融合固体培养基，随后用基因特异性引物对进行菌落PCR 验证。
4. 将阳性酵母菌落在新鲜培养基上繁殖 SD-Trp板，使用Zymoprep提取酵母质粒DNA 酵母质粒Mini Prep II试剂盒
5. 然后酵母质粒DNA 转化到E的感受态细胞中。大肠杆菌菌株DH5α 程序。 E。选择携带酵母质粒DNA的大肠杆菌细胞 ?含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，随后使用进行验证菌落PCR
6. 从E中提取质粒DNA。大肠杆菌 Mo Bio UltraClean Midi Plasmid Prep试剂盒，并将等分试样进行测序确保靶基因序列和3x FLAG融合的保真度。
朝向ChIP的下一步是将融合到3x FLAG的靶基因整合到M中。 oryzae 基因组。这通过将步骤A6中分离的质粒DNA转化为M来实现。 oryzae 原生质体并选择潮霉素抗性。如先前所述（Fernandez等人，2012; Wilson等人，2010）进行原生质体产生和转化以及筛选真菌转化体，并总结为如下：
1. 菌丝体在350ml具有连续的液体完全培养基中生长在24℃下以150rpm振荡48小时，用无菌Miracloth收获并用无菌蒸馏水洗涤
2. 将菌丝体分成两部分，并且每种在29℃下在75ml的OM缓冲液中以75rpm振摇孵育。
3. 将菌丝体/OM溶液等分到两个Oak Ridge离心机中管，并在冰上用相同体积的冷ST缓冲液覆盖。后 ?在4℃下在摇摆桶中以5,000rpm离心15分钟转子，使用1ml从OM/ST接口回收原生质体无菌移液管并合并。
4. 与其轻轻混合后体积的冷STC缓冲液，原生质体沉淀在4℃下以3,000rpm离心10分钟，然后洗涤三次 ?在20ml冷STC缓冲液中。
5. 将原生质体沉淀重悬浮于冷STC缓冲液中，得到2-5×10 8原生质体/ml的终浓度。
6. 将100μl原生质体（?1×10 7个）与5μg质粒DNA混合， ?并在室温下温育20分钟。原生质体和DNA是然后通过轻轻倒转管子与1ml PTC缓冲液轻轻混合，并将溶液在室温下再温育20分钟
7. 为了选择转化体，接下来是原生质体/PTC溶液与100ml冷却但熔融（45℃）的底部介质混合并倾倒（?25ml /板）。然后使板固化在黑暗中在24℃下孵育至少24小时。底部培养基是然后用相同体积的含有200μg/ml的顶部培养基覆盖潮霉素B，并将平板在黑暗条件下温育直至菌落出现（约2-3周）。
8. 潮霉素抗性通过PCR筛选菌落用于靶基因-3x FLAG基因组整合 ?使用基因特异性引物对。靶基因的表达可以是通过定量实时PCR（qRT-PCR）和免疫印迹进一步验证使用ANTI-FLAG抗体进行分析。
制备用于ChIP的真菌菌丝体
1. 一旦M。表达与3x FLAG融合的靶基因的oryzae 菌株已经验证，然后可以长大以用于ChIP分析。真菌 ?携带靶基因-3x FLAG融合体的菌株在琼脂上生长板前5-10天平板菌落的前缘切除并与350ml液体完全培养基（CM）混合。菌丝体 ?并将CM混合物倒入合适的烧瓶中，并允许真菌在24℃下以150rpm连续振荡生长48小时 1A）。对于一些研究，菌丝体可能被转移到第二，用于额外生长16小时。野生型菌株或携带空pHZ126载体的菌株应用作实验控制
2. 对于每个菌株，真菌菌丝体收集使用两层Miracloth和收获的菌丝体用无菌水充分洗涤（图1B-C）
  
  图1。真菌菌丝体的收集 A.携带靶标的真菌菌株基因-3x FLAG融合体在24℃下在液体完全培养基中生长。乙。 48小时后，通过过滤培养物收获菌丝体两件Miracloth放置在漏斗。菌丝体用洗涤无菌水。 C.用纸巾轻轻地拍打菌丝垫 ?去除多余的水。
用于ChIP的真菌菌丝体的两步交联[由Nowak等人（2005）修改]。
1. 第一步交联：将1g洗涤过的菌丝体悬浮于100ml 的DSG交联缓冲液并在室温下孵育45分钟 ?以100rpm连续振荡
2. 第二步交联：在最后20分钟内加入甲醛至最终浓度为1％ ?与DSG交联。
3. 终止交联：加入甘氨酸至终浓度为0.125M，并在室温下温育10分钟。
4. 用Miracloth收获菌丝体，用过量洗涤无菌蒸馏水中，在液氮中快速冷冻并储存 -80°C，直到使用。
按照制造商的方案，用CelLytic TM TM PN植物核分离试剂盒分离交联的染色质。
注意：从步骤E到F，在4°C执行所有步骤。所有缓冲液和设备应预先冷却至4°C。
1. 使用预冷的研钵和杵将交联的菌丝体在液氮中研磨成细粉。
2. 通过剧烈涡旋将100mg菌丝体粉末悬浮在1.5ml Eppendorf管中的500μl1x NIB中。
3. 将悬浮液通过2层无菌Miracloth过滤到新鲜的1.5ml Eppendorf管中
4. 将悬浮液在4℃下以1,260×g离心10分钟
5. 弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于500μlNIBA中
6. 对于细胞膜的裂解，加入15μl10％Triton X-100 至终浓度为0.3％，并将溶液温和地倒转混合
7. 将溶液在4℃下以12,000×g离心5分钟
8. 除去上清液，将沉淀重悬于500μlNIBA中
9. 将溶液在4℃下以12,000xg离心5分钟，弃去上清液。
10. 所得沉淀是粗核级分。
通过超声处理的染色质剪切
1. 将来自步骤E10的粗核级分重悬于300μl预冷却的核裂解缓冲液中
2. 染色质从核中提取并使用VirTis剪切 VirSonic 50超声波细胞破碎仪。将样品保存在冰上 ?整个过程。生成染色质片段最佳大小范围为200 bp -1,000 bp（平均片段大小为 ?500bp），20秒"开"和20秒的循环中的Microtip功率设置为4 在6分钟的总处理时间内"断开"可以用于M. oryzae 细胞核。
3. 将样品以12,000xg离心5分钟在4℃，和含有核裂解物的上清液剪切染色质转移到新管中。
注意：在初步的一系列实验中，剪切染色质的最佳超声处理参数可以通过在1.5％琼脂糖凝胶上超声处理后检查染色质DNA片段的大小，对VirTis VirSonic 50超声波细胞破碎仪破碎仪进行经验确定。随后可以调整功率水平设置或声处理的总处理时间，直到染色质DNA片段化为适当大小。
染色质免疫沉淀。
1. 包含剪切的染色质的核裂解物通过预澄清与30μlSepharose 4B珠孵育，在4℃轻轻旋转4小时 ?C。
2. 将珠子在5,000xg下在4℃下离心30秒
3. 将上清液收集成新鲜的3×100μl等分试样 Eppendorf管。一个样本被保存，直到步骤H1作为输入 ?染色质控制。所有样品置于冰上直至使用。
4. 亲和树脂根据制造商的说明书制备。
  1. 简言之，将20μl抗-FLAG M2亲和凝胶移除至无菌1.5 ?ml管。将凝胶用0.5ml HBS洗涤两次，然后用0.5ml 0.1洗涤 ?M甘氨酸HCl（pH 3.5）洗涤一次。然后用0.5洗涤三次 ml HBS。在洗涤步骤之间，通过在4℃下以5000×g旋转30秒来使树脂沉淀。
  2. 制备20μl抗IgG琼脂糖树脂 ?以与上述相同的方式并且用于确定背景非特异性染色质与凝胶结合。
5. 100μl清除将来自步骤G3的核裂解物置于含有抗-FLAG或抗IgG琼脂糖树脂，并在4℃下与之温育过夜 ?温和搅拌。
6. 树脂在0.5ml HBS中洗涤四次含有0.1％TritonX-100的缓冲液。在这些洗涤步骤后，珠 ?通过在4℃下以5,000xg旋转30秒沉淀
7. 至洗脱蛋白质-DNA复合物，向其中加入100μl洗脱缓冲液树脂沉淀并在4℃下温和搅拌孵育30分钟
8. 将样品在4℃以5,000xg离心30秒，将上清液转移到新管中。
反向交联。
注意：除了来自抗-FLAG和抗IgG琼脂糖树脂的洗脱液外，在步骤G3保存的输入染色质也包括在以下步骤中。
1. 为了消化蛋白质，在最后向每个样品中加入蛋白酶K. 浓度为0.2mg/ml，将溶液在45℃温育2小时 h。
2. 为了逆转被标记的表位的共价缔合蛋白与其直接或间接DNA靶标，将NaCl加入最终 ?浓度为0.2M，溶液在65℃下保温过夜。
分析ChIP DNA
1. 通过与ChIPed样品温育，从ChIPed样品中除去污染的RNA RNA酶A（终浓度为0.1mg/ml）在室温下反应30分钟 min。
2. 使用Wizard PCR Clean-up试剂盒纯化DNA，并洗脱至30μlddH 2 O中。
3. 定量实时PCR（qPCR）用于确定是否已知或在ChIP后，样品中富集了可疑的DNA靶序列。使用特定的引物用于感兴趣的基因（ MoSOD1 2），通过扣除来测定ChIP后的DNA富集值抗IgG琼脂糖处理的样品的背景信号 ChIP ANTI-FLAG信号，并相对于输入控制进行归一化。对于例如，Fernandez和同事（2014）证明了MoJmjC 在MoSIR2 依赖中与MoSOD1启动子物理缔合方式（图2），使得MoSOD1 DNA随后更高度富集 ?ChIP by JmjC ^FLAG在Δ sir2 JmjC ^FLAG在野生型（WT）背景中
  
  图2. ?ChIPed DNA。每个菌株进行三次生物复制。通过ChIP证明MoJmjC与MoSod1 DNA的间接结合在使用携带JMJC ^{标签的Guy11野生型（WT）和Δ 缺失菌株的两步交联后}等位基因。抗-FLAG M2亲和力 ?凝胶与小鼠抗IgG琼脂糖平行使用。的至少一式三份地进行洗脱的MoSod1 DNA的定量 ?通过qPCR使用在MoSod1启动子区中设计的特异性引物（Fernandez等人，2014年）。从ANTI-FLAG M2获得的qPCR值针对非特异性调整亲和凝胶免疫沉淀染色质结合和沉淀使用抗IgG琼脂糖值和相对于输入控件进行标准化。 MoSod1 DNA的折叠富集 ?在WT JMJCFLAG ChIP样品中相对于Δ sir2 JMJC ^FLAG ChIP样品显示。误差棒是标准偏差。酒吧用不同的字母显着不同（Student's t检验p≤0.05）。

食谱

SD-Trp固体培养基
1 M山梨醇
0.67％（w/v）无氨基酸的酵母氮源 0.074％（w/v）Trp DO补充剂
1.5％琼脂 2％（w/v）葡萄糖在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
注意：过滤灭菌葡萄糖应在高于55℃的高压灭菌后加入。
SD-Trp液体溶液
1 M山梨醇
0.67％（w/v）无氨基酸的酵母氮源 0.074％（w/v）Trp DO补充剂
2％（w/v）葡萄糖通过在121℃下高压灭菌20分钟灭菌
注意：过滤灭菌葡萄糖应在高于55℃的高压灭菌后加入。
补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板 1％细菌胰蛋白酶
0.5％酵母提取物1％NaCl
1.5％细菌琼脂通过在121℃下高压灭菌灭菌20分钟，并且当液体冷却至低于55℃时加入氨苄青霉素。
液体完全培养基
10g/L葡萄糖 2 g/L蛋白胨
1g/L酵母提取物
1 g/L酪蛋白氨基酸
0.1％（v/v）痕量元素
0.1％（v/v）维生素添加剂
6g/L NaNO 3 3/
0.5g/L KCl
0.5g/L MgSO 4 4/h 1.5g/L KH 2 PO 4 sub/
调整PH 6.5
在121℃高压灭菌30分钟
DSG交联缓冲区
20mM HEPES（pH7.4） 1mM EDTA
1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）
2mM二琥珀酰亚胺基戊二酸酯 DSG交联缓冲液应该新鲜制备。 HEPES和EDTA通过在121℃高压灭菌20分钟灭菌。 PMSF和DSG应在使用前添加。将PMSF溶解在异丙醇或乙醇中。将DSG溶解于DMSO中以制备0.5M的储备溶液，立即使用
1x NIB
1×NIB用去离子H 2 O从4×NIB稀释。然后加入DTT至终浓度为1mM。 4x NIB与CelLytic ^TM PN植物核分离试剂盒一起提供。
注意：DTT应在使用前添加。
NIBA
加入蛋白酶抑制剂混合物，比例为1:100至1x NIB
注意：蛋白酶抑制剂鸡尾酒应在使用前添加。
核裂解缓冲液
50mM HEPES（pH7.5） 150mM NaCl 1mM EDTA
1％Triton X-100 0.1％脱氧胆酸盐 0.1％SDS
10 mM丁酸钠 1mM PMSF
1％（v/v）蛋白酶抑制剂混合物
在121℃高压灭菌30分钟
HEPES缓冲盐水（HBS）
10mM HEPES（pH7.5） 150mM NaCl 在121℃高压灭菌30分钟
0.1M甘氨酸HCl（pH 3.5）溶于ddH 2 O中的0.1M甘氨酸用HCl调节pH至3.5
洗脱缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 200μg/ml 3×FLAG肽
150mM NaCl 将3×FLAG肽溶解于高压灭菌的1×TBS（PH7.5）溶液中，并在-20℃下保存。
OM缓冲区
1.2M MgSO 4 10mM NaPO 4（pH 5.8）
0.75％（w/v）葡聚糖
用1M Na 2 HPO 4调节pH 5.5，并过滤灭菌。
OM缓冲液应准备新鲜。
ST缓冲区
0.6M山梨醇 0.1M Tris-HCl（pH 7.0）
在121℃高压灭菌30分钟
STC缓冲区
1.2M山梨醇 0.1M Tris-HCl（pH7.5）
10mM CaCl 2
在121℃高压灭菌30分钟
PTC缓冲区
60％PEG 4000
10mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM CaCl 2
过滤灭菌
PTC缓冲液应该新鲜配制。
底部媒介
10g/L葡萄糖 273g/L蔗糖 2 g/L蛋白胨
1g/L酵母提取物
1 g/L酪蛋白氨基酸
0.1％（v/v）痕量元素
0.1％（v/v）维生素添加剂
6g/L NaNO 3 3/
0.5g/L KCl
0.5g/L MgSO 4 4/h 1.5g/L KH 2 PO 4 sub/
1.5％琼脂调整PH 6.5，并在121℃高压灭菌20分钟，灭菌
顶端媒体
10g/L葡萄糖 2 g/L蛋白胨
1g/L酵母提取物
1 g/L酪蛋白氨基酸
0.1％（v/v）痕量元素
0.1％（v/v）维生素添加剂
6g/L NaNO 3 3/
0.5g/L KCl
0.5g/L MgSO 4 4/h 1.5g/L KH 2 PO 4 sub/
1％琼脂
调整PH 6.5，并在121℃高压灭菌20分钟，灭菌

致谢

这项工作是由国家科学基金会（IOS-1145347）和美国农业部NIFA（2014-67013-21559）的支持。该协议从Fernandez等人（2014）修改和修改。

参考文献

Fernandez，J.，Marroquin-Guzman，M.，Nandakumar，R.，Shijo，S.，Cornwell，K.M.，Li，G.and Wilson，R.A。（2014）。植物防御抑制是由水稻感染过程中的真菌沉默调节蛋白介导的 Magnaporthe oryzae 。 Mol Microbiol 94（1）：70-88
Fernandez，J.，Wright，J. D.，Hartline，D.，Quispe，C. F.，Madayiputhiya，N.and Wilson，R.A。（2012）。稻瘟病菌中碳分解代谢物抑制的原理：Tps1，Nmr1-3和MATE-家族泵在感染期间调节葡萄糖代谢。 PLoS Genet 8（5）：e1002673。
Marroquin-Guzman，M.和Wilson，R.A。（2015）。 GATA依赖性谷氨酰胺分解通过抑制TOR抑制驱动Magnaporthe oryzae中的吸附形成of cAMP/PKA signaling。 PLoS Pathog 11（4）：e1004851。
Nowak，D.E.，Tian，B.and Brasier，A.R。（2005）。通过染色质免疫沉淀鉴定NF-κB基因网络的两步交联方法。 a> Biotechniques 39（5）：715-725
Wilson，R.A.，Gibson，R.P.，Quispe，C.F.，Littlechild，J.A。和Talbot，N.J。（2010）。 NADPH依赖性遗传开关调节稻瘟病真菌的植物感染。 Proc Natl Acad Sci USA 107（50）：21902-21907。
Zhou，X.，Li，G.and Xu，J.R。（2011）。在丝状真菌中产生GFP融合和表位标记构建体的有效方法 Methods Mol Biol 722：199-212。