材料和试剂

手术刀。 24（VWR International，目录号：233-5487）
细胞过滤器（100μm和70μm）（BD Biosciences，目录号：352360和352350）
注意：目前，它是"康宁，目录号：352360和352350"。
黑色96孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655076）
16孔E板（E板16）（ACEA BIO，目录号：06465382001）
组织培养处理的Falcon 96孔板（BD Biosciences，目录号353072）
注意：目前，它是"康宁，目录号：353072"。
Nunc TM细胞培养处理的EasYFlasks ^TM（Thermo Fisher Scientific，目录号：156499）
BALB/c（或任何选择的品系）8-12周龄雄性或雌性小鼠（Charles River Laboratories）
Hank平衡盐溶液（HBSS）w /钙/镁（Biowest，目录号：L0612-500）
胶原酶I型（Sigma-Aldrich，目录号：C0130-100MG）
使用MesenPure TM sup（TM）（小鼠）（STEMCELL Technologies，目录号：05512）的MesenCult TM扩增试剂盒。
青霉素 - 链霉素10,000U/ml（Life Technologies，Gibco，目录号：15140-122）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM目录号：15140-122"。
稳定谷氨酰胺200mM（Biowest，目录号：X0551-100）
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium（Biowest，目录号：L0615-500）
TrypLE ^TM Express Enzyme（1x）（Life Technologies，目录号：12604021）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM目录号：12604021"。
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10309433）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154-20ml）
CellTiter-Blue试剂（Promega Corporation，目录号：G8081）
I型胶原酶（参见配方）
完成MesenCult介质（参见配方）

设备

无菌不锈钢剪刀和镊子
Neubauer细胞计数室（VWR International，目录号：631-1111）
细胞培养孵化器（THERMO，型号：HEPA class 100）
相差显微镜（OLYMPUS，型号：CKX41）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
xCELLigence RTCA站和控制单元（膝上）与RTCA软件（ACEA BIO/ROCHE）
Fluorometro [Glomax多检测系统（Promega Corporation）或等同物]

程序

隔离mASCs
间充质基质细胞从腹股沟（皮下）和性腺（在雄性小鼠中附着于附睾/睾丸的腹内脂肪沉积物和卵巢/雌性小鼠的子宫）脂肪垫中分离。
1. 通过颈部脱位牺牲小鼠，并无菌去除脂肪组织并将其收集在含有10ml冰冷HBSS的50ml管中（注1）。
2. 在含有2％HBSS的10ml HBSS中洗涤脂肪组织两次，（v/v）青霉素/链霉素在室温（RT）和转移脂肪到培养皿。尽可能多地除去液体并称重 ?脂肪。使用无菌剪刀或手术刀刀片切割脂肪组织小块（≤3 mm ³）。
3. 重悬在2.5毫升的切碎的脂肪组织含有2mg/ml I型胶原酶的HBSS（相当于1-5FALGPA 单位和≥625胶原消化单位（CDU）/g脂肪组织）和将混合物转移到15ml管（<5ml）或50ml管（≥5ml）中。 ?将管置于37℃水浴中30分钟;轻轻涡旋管 ?每5分钟10秒。
4. 加入10毫升HBSS消化的脂肪溶液，并使用100μm细胞过滤器过滤（注2）。
5. 旋转释放的细胞（300×g，在4℃下7分钟），吸出上清液（注3），并将沉淀重悬于10ml HBSS中。
6. 使用70μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并通过离心（300×g，4℃，7分钟）沉淀细胞。
7. 在2 ml完全Mesencult培养基中重悬沉淀，计数细胞使用台盼蓝。我们通常获得0.25±0.03g脂肪/小鼠（平均值± SEM，n = 6）和1.9±0.4×10 6个细胞/g脂肪（平均值±SEM，n = 11）。
8. 在组织培养物处理的Nunc EasYFlasks中以20-30,000个细胞/cm 2在完全Mesencult培养基中平板释放的细胞。
9. 24小时后，更换培养基，以去除未附着的细胞和碎片。
细胞培养
使用完全Mesencult在37℃，5％CO 2，21％O 2，90％相对湿度（RH）在75cm 2中培养贴壁细胞（T75）Nunc EasYFlask在10,000个细胞/cm 2下。
1. 当培养物达到80-90％汇合时，用10ml PBS洗涤细胞两次。
2. 加入2ml TrypLE/T75烧瓶并在37℃孵育5分钟。轻按在瓶的侧面，以便分离细胞，然后加入8ml ?的含有2％FBS的PBS。
3. 轻轻重悬细胞，直到获得均匀的细胞悬液，并以300×g离心5分钟。
4. 如下所述计数细胞并将细胞以10,000接种细胞/cm 2并扩增培养物直至达到80-90％融合。 mASCs可用于3-7（注4）。
5. 表型来自Balb/c小鼠的第3代mASCs，通过流式细胞术测量 CD11b （0.6±0.2％），CD31 sup-（0％），CD45 sup-（0.03±0.06％），sca-1 < sup> + （80.3± 14.5％），CD29 +（99.9±0.1％）和CD44 +（99.8±0.2％）。表达方式水平显示为表达相对标志物的群体的％到相应的同种型对照染色（平均值±标准偏差，n = 3）。表达范围可以在小鼠品系之间变化。小鼠MSC分化成成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞（Anderson等人，2013; Peister等人，2004）可以是使用来自例如干细胞的商业分化试剂盒进行技术（ http://www.stemcell.com ）和Lonza（ http://www.lonza.com ）。

扩散（注5）

准备mASCs（3-7代）用于增殖测定
1. 如上所述收获细胞。
2. 轻轻地，但彻底地重悬细胞沉淀在2毫升 Mesencult /汇合T75培养瓶中以获得5×细胞浓度 ?10 5个和1×10 6个细胞/ml。
3. 稀释细胞悬液1：1在台盼蓝（20微升细胞悬浮液+ 20微升台盼蓝）。
4. 计数。混合好，加入10μl到一个Neubauer计数室，并计数四个角的正方形（注6）。
5. 准备10,000细胞/ml的工作溶液在完全Mesencult ?使用xCELLigence或6,600个细胞/ml测量细胞增殖用于使用CellTiter-Blue试剂测量细胞增殖将管保持在冰上（注7）。
xCELLigence
xCELLigence 系统可用于实时测量细胞增殖和使用其中孔底部被覆盖的特定细胞培养板电极（图1）。将细胞附着到电极增加它们的阻抗被显示为小区索引的增加。的细胞指数给出关于细胞数量，活力和形态的信息 ?。 xCELLigence RTCA站应放置在单元格中设定在37℃，21％O 2，5％CO 2，90％RH的培养箱中。

图1.组件的xCELLigence系统。左侧面板显示了使用的16孔E盘用于测量贴壁细胞的增殖。中间面板显示 DP RTCA站与其三个集成站为电子版。的 ?右侧面板给出了RTCA软件如何可视化单元格的示例通过绘制细胞指数对时间的实时增殖。
1. 在无菌罩中，在16孔中加入100μl/孔的完全Mesencult E盘，盖上盖子，放在xCELLigence RTCA站。检查连接和电池索引读数，以确保 16孔E板正确安装。离开16孔E盘 ?xCELLigence RTCA站30-45分钟，然后测量背景在没有细胞的情况下的阻抗
2. 从中取出E板 xCELLigence RTCA站，并将其放置在无菌罩。涡旋管 ?含有10,000mASC/ml以重悬细胞并小心加入100μl ?μl的细胞悬液（在步骤C1e中制备）/孔，一式两份小心不要触摸井的底部与提示。最后体积/孔现??在应为200μl。
3. 将mASCs留在细胞培养箱中的xCELLigence RTCA站中7天，每小时读取阻抗（注8）。
4. 绘制细胞指数与培养物中的时间（参见下面的图2）。
CellTiter-Blue
这个 ?方法是基于刃天青到荧光的转换代谢活性细胞产生试卤灵。荧光信号 ?获得的数量与培养物中的活细胞数量成比例。
1. 加入150微升的细胞悬浮液/孔在平底96孔组织培养板（每孔含约1,000个细胞）一式三份。使1板/时间点。单独添加培养基一式三份加入每个板中作为背景对照。放置在设定为37℃，5％CO 2，21％O 2，90％RH的细胞培养箱中。
2. 在第1,3和5-6天读板。加入30μlCellTiter-Blue 试剂/孔，轻轻敲打板的侧面并孵育该板再保持4小时。
3. 转移100微升从每个孔到黑色 96孔板并在荧光测定法中读取荧光（Glomax 多检测系统或等同物）在560 Ex/590/590 Em。
4. 减去 ?来自样品荧光和图的平均背景荧光荧光（增殖）对时间（参见下面的图2）
  
  图 ?2.代表性数据显示mASCs的增殖使用 xCELLigence系统（左图）和CellTiter-Blue试剂（右图）面板）

笔记

用70％乙醇彻底喷雾处死小鼠的腹部，并使用医用注射器针头将动物，腹侧向上固定在聚苯乙烯支持物上。使用一套无菌剪刀/镊子仔细做一个中线切口，小心不要损伤腹膜。将皮肤与腹膜分开，用注射器针固定皮瓣。当获取腹股沟脂肪垫时，应注意去除在血管的Y形交叉处嵌入脂肪中的腹股沟淋巴结。使用一套新的无菌剪刀/镊子，收集腹股沟脂垫，并将其转移到含有10毫升HBSS的50毫升管，并保持在冰上。继续切开腹膜，注意不要损伤肠。收集附着在雄性和雌性小鼠的睾丸和卵巢上的生殖腺脂肪垫。当分离mASCs时，我们从两个位置汇集脂肪。然而，已经报道了MSC表型的贮库特异性差异，并且取决于您的科学目标，可能必须从一个位置或另一个位置分离mASC。
溶液可以是粘稠的，可能需要使用几个细胞过滤器
在以下步骤中的沉淀是松散的，并且在去除上清液时应该小心
我们将mASCs以10,000个细胞/cm 2的浓度接种，这允许我们每3-4天传代细胞。在这些培养条件下，我们已经能够使用xCELLigence系统或CellTiter-Blue试剂测量来自第3-7代的mASC的增殖。然而，应当注意，mASC的大小随着传代数的增加而增加，而它们的增殖能力降低。因此，当将它们的增殖能力与上述方法比较时，最好使用具有相同传代数的mASC细胞系。
我们提供测量mASC增殖的两个协议。 CellTiter-Blue试剂易于使用，在大多数实验室都可行。然而，一些研究已经显示，刃天青可以在长时间暴露时影响细胞活力，并且包含增加线粒体数量/活性的药物可以给出错误的结果。 xCELLigence系统需要购买RTCA站/软件和专用E盘的成本。然而，xCELLigence系统实现了无标记和非侵入性实时扩增测量。当在体外研究mASC增殖时，通常并行使用两种方法。要获得有关CellTiter-Blue试剂和xCELLigence系统的更多信息，请阅读制造商的说明。
我们优选计数平均20-50个细胞/角正方形，以获得可靠的细胞浓度。使用以下公式计算细胞浓度：（四个角正方形中的细胞总数/4）×2（稀释倍数）×10,000 =无。细胞/ml
我们发现添加1,000个mASC /孔（3,125个细胞/cm 2）允许在培养物达到融合之前监测mASC增殖5-7天。该细胞数目给出可重现的生长曲线，其包括根据图1的初始24-48h滞后期，接着是增殖期。
在实验过程中，我们通常不向培养板中加入新鲜培养基。然而，可以暂停实验，去除E板，添加另外100微升培养基/孔，并重新开始阻抗测量。

食谱

I型胶原酶将I型胶原酶（100mg）溶于10ml HBSS中至10mg/ml的浓度。
将0.5ml的等分试样储存在-20℃下
完成MesenCult介质
在4℃下融化MesenCult ^TM干细胞刺激性补充剂（小鼠），稳定的谷氨酰胺，青霉素/链霉素，并混合：
400ml MesenCult MSC基础培养基（小鼠）
100 ml MesenCult干细胞刺激性补充剂（小鼠）
5ml稳定的谷氨酰胺（终浓度：2mM） 5ml青霉素/链霉素（终浓度：100U/ml） 0.5 ml Mesenpure（可选）
将完整的MesenCult存储在4°C，并在一个月内使用

致谢

这项工作由来自欧洲联盟的Fondo de Investigaciones Sanitarias ISCIII（西班牙）和Fondo Europeo de Desarrollo区域（FEDER）资助，通过研究拨款NoPI12/01390（PA），NoPI12/01097和ISCIII Red de Terapia Celular （授予NoP09-CTS-04532和PAIDI-Bio-326）和Consejeríade Salud（授予NoPI0001/2009）的产品（TerCel：RD12/0019/0006） deAndalucía和FEDER/Fondo de Cohesion Europeo（FSE）deAndalucía2007-2013 to FM P.A有一个Miguel Servet合同（CP09/00228），由来自欧盟的Fondo Europeo de Desarollo区域（FEDER）共同资助。调频。由FundaciónProgreso y Salud（Consejeríade Salud - Junta deAndalucía）资助。

参考文献

Anderson，P.，Carrillo-Gálvez，A. B.，Garcia-Perez，A.，Cobo，M. andMartín，F。 CD105（内皮素） - 阴性鼠间质基质细胞定义了具有不同分化和免疫调节能力的新的多潜能亚群。 PLoS One 8（10）：e76979。

Carrillo-Gálvez，AB，Cobo，M.，Cuevas-Ocana，S.，Gutierrez-Guerrero，A.，Sanchez-Gilabert，A.，Bongarzone，P.，Garcia-Perez，A.，Munoz，P.，Benabdellah ，K.，Toscano，MG，Martín，F。和Anderson，P。（2015）。间充质基质细胞在其表面表达GARP/LRRC32：对其生物学和免疫调节能力的影响。 a> Stem Cells 33（1）：183-195。

Peister，A.，Mellad，J.A.，Larson，B.L.，Hall，B.M.，Gibson，L.F.and Prockop，D.J。（2004）。从不同种系的近交小鼠中分离的来自骨髓的成体干细胞（MSC）在表面表位，增殖速率和分化潜能。血液 103（5）：1662-1668。