部分I.完整的棕色脂肪细胞呼吸

材料和试剂

注意：鱼藤酮，抗霉素，寡霉素和FCCP是有毒和光敏感的。在黑暗中处理和储存库存时，请穿戴个人防护装备。

3-4周龄的C57BL6/J小鼠
注意：从棕色脂肪组织中分离初级前脂肪细胞，然后在XF-24孔细胞培养板中将其分化7天。
XF测定24孔盒和细胞培养微板（Seahorse Bioscience，目录号：100850-001和100777-004）
XF测定24孔筒和实用板
DMEM（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：12100-046）
ewborn小牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：N4887）
HEPES（Corning，目录号：25-060-Cl）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-164）
青霉素 - 链霉素溶液（100x）（Corning，目录号：30-002-Cl）
钠抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
罗格列酮（用作分化剂）（Toronto Research Chemicals，目录号：R693500）
来自猪胰岛素的胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I5523）
XF-测定/基础培养基（Seahorse Bioscience，目录号：102365-100）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
XF校准溶液（Seahorse Bioscience，目录号：100840-000）
L - （ - ）去甲肾上腺素（+） - 酒石酸盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：N5785）
游离脂肪酸（棕榈酸或油酸酯）（Sigma-Aldrich，目录号：P0500）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
RPMI培养基（无葡萄糖）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11879-020）
无脂肪酸BSA（CalBiochem，目录号：126575）
BAT分化培养基（参见配方）
海马测定培养基（SH测定培养基）（参见配方）
游离脂肪酸与BSA结合（参见配方）
去甲肾上腺素（见配方）
寡霉素（Sigma-Aldrich，目录号：75371）（参见Recipes）
来自链霉菌属（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）（参见Recipes）
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）（参见配方）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P5280）（参见Recipes）

设备

CO 2无孵化器
8％CO 2培养箱
XF24胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）
细胞培养罩
pH计
37°C水浴

程序

根据Cannon和Nedergaard（2001）分离来自3-4周龄C57BL6/J小鼠的前脂肪细胞。在BAT胶原酶消化和洗涤步骤后，将细胞沉淀重悬于4ml BAT分化培养基中
将70μl重悬浮的沉淀物重悬于V7XF 24孔细胞培养板的每个孔中，使细胞在细胞培养罩中附着1小时，然后加入180μlBAT分化培养基并放入8％CO 2 孵化器（在这个阶段，由于从分离程序留下的碎片和红细胞，获得精确的细胞计数是困难的）。第二天，用150微升培养基轻轻洗涤细胞两次，以确保红细胞被洗出，并添加250微升的新鲜培养基。每隔一天更换培养基，接下来的7天或直到前脂肪细胞分化。分化可以通过脂肪细胞中的脂滴形成或通过UCP1表达的Western印迹分析来评估（参见代表性数据图??1和2）。
在开始呼吸测定之前，在CO 2 sub-free培养箱中用1ml XF Calibrant每孔浸泡小室至少3小时。
用SH测定培养基洗涤细胞一次，然后向板的24个孔中的每个孔中加入450μlSH测定培养基
在装载到XF 24细胞外分析仪中之前，在37℃下在CO 2无培养箱中孵育板30分钟。
在这30分钟内，在测定期间（50μl/端口A，55μl/端口B，60μl/端口C，65μl/端口D）装载含有氧探针的柱的端口并校准柱体。
运行海马测定，2分钟混合和4分钟测量（无等待）。 6次测量基础，5次测量后寡聚霉素和FCCP注射和超过5次测量后建议使用抗霉素A。

代表数据

图1.具有胰岛素和罗格列酮的棕色脂肪细胞分化 a）分化的（与罗格列酮）与未分化细胞（无罗格列酮）的UCP1免疫染色。注意荧光强度的差异。 b）在存在和不存在胰岛素和罗格列酮的情况下，在分化的棕色脂肪细胞中对UCP1和孔蛋白的Western印迹。（Wikstrom 等人，2014）

图2.分离后24小时的前脂肪细胞和分化7天后成熟棕色脂肪细胞的代表性图像

图3.注射A）NE + P，NE或单独的棕榈酸，B）寡霉素和C）抗霉素A的代表性OCR图。

笔记

成功的NE活化表达UCP1的棕色脂肪细胞导致氧消耗速率的快速增加。如果OCR增加≤3倍，这表明棕色脂肪细胞未被充分分化。

食谱

BAT分化培养基
准备补充有以下物质的DMEM（在4℃下有效6周）： 10％新生小牛血清
10 mM HEPES
4mM谷氨酰胺 50 IU青霉素
50μg链霉素 100μg/ml L-抗坏血酸钠准备50ml的BAT分化培养基（4℃下1周有效）：
50毫升的股票
60 nM胰岛素
1μM罗格列酮
海藻测定培养基（SH测定培养基）（PH = 7.4并过滤）
XF测定培养基
库存包含：
0.8mM Mg 2+ +
1.8mM Ca 2+ 2 +
143 mM NaCl 5.4 mM KCl
0.91mM NaH 2 PO 4 4·h/v 2mM L-Ala-Gln（Glutamax）
酚红3mg/ml
实验当天：将3mM葡萄糖新鲜加入到XF-测定培养基中，在37℃和无菌过滤器下pH为7.4，
与BSA结合的游离脂肪酸（0.4mM; FFA：BSA，4:1）
将游离脂肪酸（棕榈酸盐或油酸盐）溶于DMSO至0.4M的最终浓度，然后在43℃下在含有6.7％无脂肪酸的BSA的RPMI培养基（无葡萄糖）中溶解该溶液，以制备10×储备液mM）
等分并存储在-80°C
去甲肾上腺素
在SH测定培养基中以10mM的原液浓度新制备L - （ - ）去甲肾上腺素（+） - 酒石酸氢盐一水合物，并以1μM的终浓度使用
寡霉素
准备20mM在DMSO中的储备液，并储存在-20℃下在实验当天，稀释在SH测定培养基中以制备50μM（10x）溶液装载到盒端口中。
最终浓度为5μM
抗霉素A
准备40mM在DMSO中的储备液，并储存在-20℃下在实验当天，在SH测定培养基中稀释以制备待装载到盒端口中的80μM（10x）溶液。
最终浓度为8μM
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）
准备20mM在DMSO中的储备液，并储存在-20℃下在实验当天，在含有100mM丙酮酸钠的SH测定培养基中稀释，以制备待装载到盒端口中的50μM（10x）溶液。
最终浓度为5μM，用10mM丙酮酸钠

丙酮酸钠
溶于SH试验介质中，浓度为100mM（pH = 7.4，过滤）最终浓度为10mM。

基材	溶剂	集中（10x）/媒体	最终集中	评论
去甲肾上腺素	-	10μM/SH测定培养基	1μM
FFA：BSA	RPMI无葡萄糖	4mM/RPMI无葡萄糖	0.4mM; 4：1
寡霉素	DMSO	50μM/SH测定培养基	5μM
抗霉素A	DMSO	80μM/SH测定培养基	8μM
FCCP	DMSO	50μM/SH +丙酮酸钠	5μM
丙酮酸钠	-	100 mM/SH测定培养基	10 mM	pH = 7.4，过滤器

第二部分。渗透性棕色脂肪细胞呼吸

材料和试剂

D-甘露糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
蔗糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：S5）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P285）
六水合氯化镁（MgCl 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：M33）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N，N'-四乙酸四钠盐（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E8145）
脂肪酸游离BSA（EMD Millipore Corporation，CalBiochem，目录号：126575）
L - （ - ） - 苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：02288）
琥珀酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：S3674）
寡霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：75371）
来自链霉菌属（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）
罗望酮（Sigma-Aldrich，目录号：R8875）
（+） - 乙莫克舍钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：E1905）
腺苷5'-二磷酸单钾盐二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A5285）
L - （ - ） - 肉碱（Thermo Fisher Scientific，Acros Organics，目录号：241040100）
琥珀酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：S3674）
L - （ - ） - 苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：02288）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P5280）
棕榈酰基-L-肉碱氯化物（Sigma-Aldrich，目录号：P1645）
棕榈酰辅酶A锂盐（Sigma-Aldrich，目录号：P9716）
3x MAS缓冲区（参见配方）
XF PMP试剂（Seahorse Bioscience，目录号：102504-100）（参见Recipes）

设备

与完整的棕色脂肪细胞呼吸协议相同的设备

程序

准备细胞，如完整的棕色脂肪细胞呼吸协议的步骤1-2所述
在实验当天，解冻1x MAS和食谱部分1中描述的预制底物溶液。
在1x MAS中制备10x抑制剂溶液。如果使用脂肪酸底物，请按照配方第2b节中所述新鲜制备
1. 在装载之前，在CO 2 2-free培养箱中将小柱至少浸泡3小时。
2. 负载端口：端口A为50μl，端口B为55μl，端口C为60μl，端口D为65μl，校准盒。
3. 在1x MAS中制备7.5nM PMP，体积足以每孔450μl
4. 轻轻地用1x MAS缓冲液洗一次细胞。
5. 完全排空洗涤，加入含有7.5 nM PMP的450μl1x MAS。不需要在CO 2无培养箱中孵育。
6. 立即加载平板，并用3分钟混合物和2运行海马测定 ?min测量（无等待）。每个条件进行2-3次测量。不要在抗霉素A注射前超过1小时的测定时间线粒体完整性将受到影响。

代表数据

图4.用A）琥珀酸盐+ ADP +鱼藤酮，B）寡霉素和C）抗霉素注射的透化的BAT的代表性OCR图

笔记

确保透化的最简单的方法是检测由膜不可渗透的底物琥珀酸酯引起的呼吸。琥珀酸也可用于滴定最佳XF PMP试剂浓度
始终加载所有四个进样口。如果不使用一个端口，请加载1x MAS缓冲区。
每个条件至少使用三个技术重复。
为了确保数据的质量，确保pH在整个运行期间是稳定的，并且每次测量后氧气张力恢复到基本水平。
如果OCR超过2,000 pmol/min，请转到海马Excel数据查看器中的"特殊操作"选项卡，单击"更改O2计算方法"并选择"增益（固定）"算法，因为AKOS算法不会处理高OCR数据正确。始终将增益（固定）数据表示为基线测量的百分比。
有关透化的更多信息，请参阅Divakaruni等人（2014年）和Salabei等人（2014年）。

食谱

3x MAS缓冲区

试剂	集中	金额1 L MAS
甘露醇	660 mM	120.23克
蔗糖	210 mM	71.88克
KH ₂ PO ₄	30 mM	4.08克
MgCl 2	15 mM	15ml的1.0M溶液
HEPES	6 mM	加入6ml 1.0M溶液
EGTA	3 mM	12ml 0.25M溶液
脂肪酸游离BSA	0.6％（w/v）	6.0克

将试剂溶于双蒸水中，用KOH将pH值调至7.2，无菌过滤，并在-20℃下保存可选：在双蒸水中稀释至1X，用KOH稀释至pH 7.2，无菌过滤，并储存在-20°C

XF PMP试剂
储液：10μM
储存：-20°C
库存解决方案

试剂	MW	集中	溶剂	评论
马拉泰	134.09	1.0 M	ddH ₂ O	用KOH将pH调节至7.2。溶液是强酸性的，根据最终体积计算摩尔浓度
琥珀酸盐	270.1	1.0 M	ddH sub 2 O	用KOH缓冲至pH7.2
寡霉素	791.06	20 mM	DMSO	复合V抑制剂
抗菌素A	548.63	40 mM	DMSO	复合物III抑制剂
FCCP	254.17	40 mM	DMSO	化学脱离剂
Rotenone	394.4	40 mM	DMSO	复合物I抑制剂
Etomoxel	338.76	40 mM	DMSO	CPT-1抑制剂阻断棕榈酰辅酶A转化为棕榈酰肉碱
ADP，K +盐	501.32	用作粉末
L - （ - ） - Carnitine	161.2	用作粉末

基板

基板	MW	10x浓度。港口注入	添加剂（10x浓度，用于进样口）
琥珀酸盐	270.1	100 mM	40mM ADP，50μMrotenone
马拉泰	134.09	30 mM	40 mM ADP
丙酮酸	110.94	100 mM	40mM ADP，30mM苹果酸盐
棕榈酰肉碱	436.07	1 mM	40mM ADP，30mM苹果酸盐，5mM肉碱
棕榈酰-CoA	1,004.94	1 mM	40mM ADP，30mM苹果酸盐，5mM肉碱

在1×MAS缓冲液中制备琥珀酸盐，苹果酸盐和丙酮酸盐，用KOH调节pH ?至7.2。无菌过滤器，等分试样和存储在-20°C
1. 例如，对于5ml琥珀酸盐溶液，加入 0.5ml 1.0M琥珀酸盐，100.2mg ADP，1.67ml 3x MAS和2.83ml ddH 2 O 并用KOH调节pH至7.2。（在实验当天加入鱼藤酮）
2. 对于每100μl额外的体积，作为pH滴定的结果，添加50微升3x MAS以保持渗透强度。
3. 例如，如果5ml琥珀酸盐溶液的最终体积为5.1ml， ?加入50μl3x MAS。这将导致试剂的轻微稀释其不应显着影响测定。但是，考虑到这一点可变性，我们建议准备大批量的解决方案和使用给定项目中所有实验的相同库存。
对于脂肪 ?酸，制备添加剂（除肉碱外）在1x MAS中的溶液缓冲液中，并且在实验日之前用KOH调pH至7.2。无菌过滤，等分，并储存在-20°C。添加肉碱和脂肪酸溶液在实验当天。

致谢

渗透性棕色脂肪细胞呼吸方案改编自Divakaruni等人（2014）。这项工作由国家卫生研究院授予R01DK074778，R01DK56690-11和由瑞典研究委员会以及DIABAT FP7，协作EU格兰特HEALTH-F2-2011-278373和Wallenberg基金会支持。

参考文献

Cannon，B。和Nedergaard，J。（2001）。来自棕色脂肪组织和克隆棕色脂肪细胞样细胞系的脂肪前体细胞培养物。/a> Methods Mol Biol 155：213-224
Divakaruni，A.S.，Rogers，G.W.and Murphy，A.N。（2014）。使用海马XF分析仪或克拉克型氧电极测量透化细胞中的线粒体功能。 a> Curr Protoc Toxicol 60：25 22 21-25 22 16.
Salabei，J.K.，Gibb，A.A。和Hill，B.G。（2014）。使用细胞外通量分析来综合测量透化细胞中的呼吸活性。 Nat Protoc 9（2）：421-438。
这些研究结果表明，这些研究结果表明，该方法可以有效地解决这些问题，。激素诱导的线粒体分裂被棕色脂肪细胞用作能量消耗的放大途径。/a> EMBO J 33（5）：418-436