设备

个人计算机（需要互联网连接）（Intel Core i5-2300 CPU，8 GB RAM）

序列数据和软件

顺序数据编译
感兴趣的基因组的编码序列（CDS）和蛋白质序列应从相关数据库下载。包含相对大量的测序植物基因组的推荐数据库是Phytozome（ http://www.phytozome.org/）（Goodstein，Shu等人，2012）。可以从miRBase中获得感兴趣的基因组的微RNA（ http://www.mirbase.org/）（ Kozomara和Griffiths-Jones，2014）或内部测序数据
所需的软件和在线工具
以下软件应在本地计算机中安装：
1. Hmmer 3.0（ http://hmmer.janelia.org/）（Johnson，Eddy em et al。，2010），for 执行局部隐马尔可夫模型（HMM）搜索NBS同源蛋白质
2. NCBI BLAST ⁺或NCBI BLAST （ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），用于执行本地blastp 搜索NBS同源蛋白
3. ActivePerl 5.14.2（ http://www.activestate.com/activeperl/downloads ），适用于运行以perl语言编写的脚本这些软件的安装/操作手册可以在推荐网站下载。
  要使用的在线工具是：
4. COILS（ http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）（Lupas， Van Dyke等人，1991），用于鉴定卷曲螺旋的程序（CC）结构域
5. Pfam（ http：//pfam。sanger.ac.uk/）（Finn，Bateman et al。，2014），一个用于鉴定蛋白质结构域的数据库
6. psRNATarget（ http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）（Dai和 Zhao，2011），一个设计用于预测微小RNA靶标的网站植物。

程序

准备查询文件和本地数据库
对于感兴趣的给定植物基因组，执行以下操作：
1. 下载所有蛋白质编码基因的所有CDS和蛋白质序列 ?相关数据库如phytozome（ http://www.phytozome.org/）（Goodstein等人，2012）。确保每个基因具有相同的名称 CDS和蛋白质序列文件
2. 下载HMM配置文件和 ?NB-ARC结构域的延长的氨基酸序列（Pfam no.PF00931）从Pfam数据库（ http://pfam.sanger.ac.uk/）（Finn et al。，2014）。
3. 从相关数据库中下载所有microRNA序列，如 miRBase（ http://www.mirbase.org/）（Kozomara和Griffiths-Jones，2014）或制备包括所获得的所有微RNA序列的fasta文件 ?在内部实验。
4. 创建一个本地数据库下载的蛋白质序列，用于使用formatdb程序进行blast搜索 ?的爆炸软件（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast。 cgi ）。
  
  图1.我们的过程中描述的步骤的流程图
NBS基因的计算鉴定
1. 对包含蛋白质的fasta文件执行HMM搜索你使用hmmer中的hmmsearch.exe程序下载的序列 3.0包（Johnson，Em等人，2010），其具有NB-ARC的HMM轮廓域作为默认设置中的查询。
2. 运行本地BLASTp搜索 ?针对在方法步骤A4中产生的蛋白质数据库 ?使用NB-ARC结构域的氨基酸序列作为查询。的阈值期望值设置为1.0，如在以前的研究中使用的（Li等人，2010; Shao等人，2014）。
3. 检索基因名称来自HMM搜索和BLAST搜索的结果的潜在NBS基因将它们组合在一起以获得最大命中数。
4. 这些基因名称用于从蛋白质中检索蛋白质序列 ?在过程步骤A1中下载的数据集。可以实现该步骤如果在基因组中仅发现少数NBS基因，则可以手动进行。对于大数据集，我们建议研究人员为此编写一个Perl脚本步骤（脚本也可以从作者请求）。
5. 将获得的序列进一步进行在线Pfam分析 ?以验证他们是否确实拥有NBS域，具有E值设置为10 ^-4（图2A）。没有可检测的序列 NB-ARC域被丢弃。剩余的序列代表所有NBS 蛋白质。
6. Pfam分析也很重要检测这些蛋白质是否具有N-末端收缩/白细胞介素-1 受体（TIR）结构域或抗性粉纹MILDEW8（RPW8）结构域或a ?C-末端LRR结构域（Meyers等人，2003）。蛋白质序列不具有通过Pfam的可检测的N-末端结构域进一步分析使用COILS服务器（ http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）（Lupas等人，1991） ?在默认设置下检测他们是否有盘绕线圈域在N端。
  
  图2.步骤A）B5和B）C2
  的屏幕截图
鉴定可能被微小RNA靶向的NBS基因
1. 为了预测由微小RNA靶向的NBS基因，检索CDS序列通过从下载的CDS中搜索基因名称来识别NBS基因数据集。
2. 提交对应于所识别的CDS的序列 ?NBS基因和microRNA到psRNATarget服务器（ http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）（Dai和Zhao，2011） fasta 格式用于微小RNA靶标预测（图2B）。
  注意：在这里步骤，研究人员可以更改参数设置限制或扩大预测目标的数量。例如，可以设置最大期望（从不匹配罚分转换）到3以获得较少的假阳性预测率较低;或设置最大值 ?期望5以最大化潜在目标的数量更高的假阳性预测风险。
3. 下载来自psRNATarget服务器的预测结果并检索这些NBS 预测被微小RNA靶向的基因
4. 预测微小RNA对NBS基因的调控可以通过实验验证通过它们在烟草叶中的共表达，如几个中所述研究（Liu et al。，2014; Yu and Pilot，2014）。

致谢

该协议改编自Shao等人（2014）。这项工作得到中国国家自然科学基金（30930008,31170210,91231102和31400201），中国博士后科学基金（2013M540435和2014T70503）的支持。

参考文献

Dai，X.和Zhao，P.X。（2011）。 psRNATarget：植物小RNA靶分析服务器。 Nucleic Acids Res 39（Web服务器问题）：W155-159
Finn，RD，Bateman，A.，Clements，J.，Coggill，P.，Eberhardt，RY，Eddy，SR，Heger，A.，Hetherington，K.，Holm，L.，Mistry，J.，Sonnhammer，，Tate，J。和Punta，M。（2014）。 Pfam：蛋白质家族数据库 Nucleic Acids Res 42（数据库问题）：D222-230。
Goodstein，DM，Shu，S.，Howson，R.，Neupane，R.，Hayes，RD，Fazo，J.，Mitros，T.，Dirks，W.，Hellsten，U.，Putnam，N.and Rokhsar， DS（2012）。 Phytozome：绿色植物基因组学的比较平台 Nucleic Acids Res 40（数据库问题）：D1178-1186。
Johnson，L.S.，Eddy，S.R.and Portugaly，E。（2010）。隐藏马尔可夫模型速度启发式和迭代HMM搜索程序 BMC Bioinformatics 11：431.
Kozomara，A.和Griffiths-Jones，S。（2014）。 miRBase：使用深度测序数据注释高可信度microRNA。核酸研究 42（数据库问题）：D68-73。
Li，J.，Ding，J.，Zhang，W.，Zhang，Y.，Tang，P.，Chen，J.Q.，Tian，D.and Yang，S。禾本科NBS-LRR基因数量的独特进化模式 Mol Genet Genomics 283（5）：427-438。
Liu，Q.，Wang，F.and Axtell，M.J。（2014）。使用本氏烟草定量瞬时分析植物微RNA靶向的互补要求测定。植物细胞 26（2）：741-753。
Lupas，A.，Van Dyke，M。和Stock，J。（1991）。从蛋白质序列预测卷曲螺旋科学 252（ 5009）：1162-1164。
Meyers，B.C.，Kozik，A.，Griego，A.，Kuang，H。和Michelmore，R.W。（2003）。拟南芥中的NBS-LRR编码基因的全基因组分析。植物细胞 15（4）：809-834。
Shao，Z.Q.，Zhang，Y.M.，Hang，Y.Y.，Xue，J.Y.，Zhou，G.C.，Wu，P.，Wu，X.Y.Wu，X.Z.，Wang，Q.，Wang，B和Chen，J.Q.（2014）。核苷酸结合位点 - 富含亮氨酸的重复基因的长期进化：从和超越的理解豆科植物。植物生理学 166（1）：217-234。
Shivaprasad，P.V.，Chen，H.M.，Patel，K.，Bond，D.M.，Santos，B.A。和Baulcombe，D.C。（2012）。 microRNA超家族调节核苷酸结合位点 - 富含亮氨酸的重复序列和其他mRNA。 em> Plant Cell 24（3）：859-874。
Yu，S.和Pilot，G。（2014）。通过在本田烟草中的瞬时表达来测试植物人工微RNA的效率。在翻译层面的附加动作。前植物科学 5：622.
Zhai，J.，Jeong，DH，De Paoli，E.，Park，S.，Rosen，BD，Li，Y.，Gonzalez，AJ，Yan，Z.，Kitto，SL，Grusak，MA，Jackson， Stacey，G.，Cook，DR，Green，PJ，Sherrier，DJ和Meyers，BC（2011）。 MicroRNA作为植物NB-LRR防御基因家族的主调节子，通过生产分阶段， Genes Dev 25（23）：2540-2553。
Zhang，Y. M.，Shao，Z.Q.，Wang，Q.，Hang，Y.Y.，Xue，J.Y.，Wang，B.and Chen，J.Q.（2015）。揭示核苷酸结合位点 - 富含亮氨酸重复（NBS-LRR）基因的动态演变