材料和试剂

Falcon 50ml锥形管（VWR International，目录号：21008-240）
Falcon 15ml锥形管（VWR International，目录号：21008-216）
10cm培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353046）
纱，筛目尺寸约100μm（Tegosa，目录号：10018）
细胞过滤器（70μm）（Corning，Falcon ，目录号：352350）
细胞过滤器（40μm）（Corning，Falcon ，目录号：352340）
25G针（Premier Healthcare& Hygiene，BD Microlance，目录号：300600）
5ml注射器（BD，目录号：309649）
5ml圆底流式细胞术管（BD Biosciences，目录号：352063）
8至10周龄小鼠（）（男性或女性）（我们使用C57BL/6株）
Hank's平衡盐溶液培养基（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：2420-091）
青霉素 - 链霉素溶液100x（Biowest，目录号：L0022）
乙二胺四乙酸（EDTA）（AppliChem GmbH，Panreac，目录号：13102/131026）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：GCS0103-500）
APC结合的抗CD45抗体（Beckman Coulter，目录号：732158）
FITC标记的抗CD4抗体（Beckman Coulter，目录号：731999）
PE缀合的抗Ly6G抗体（Beckman Coulter，目录号：732487）
生物素化的抗F480抗体（eBioscience，目录号：13-4801）
PeyC7缀合的抗CD8抗体（Biolegend，目录号：100721）
ECD缀合的链霉抗生物素蛋白（Beckman Coulter，目录号：IM3326）
Dispase II（Life Technologies，目录号：17105-041）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17105-041"。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
分解介质（参见配方）

设备

解剖设备（钳子和剪刀）
手术刀或剃刀刀片
37℃室（Thermo Fisher Scientific，Heraeus ）
冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Heraeus ，型号：Megafuge ^TM 2.012）
Neubauer室细胞计数器
轨道振动平台（KühnerAG，Lab-Shaker）
CO 2室
Cytomics fc500流式细胞仪（Beckman Coulter）
显微镜（ZEISS，型号：Axiovert 40CFL）

程序

肠道隐窝细胞的分离
1. 由受过训练的人员在CO 2室中牺牲小鼠。执行从构造的腔室中的加压罐吸入CO 2 透明材料（如 Plexiglas）（标准尺寸的小鼠笼可能包含不超过5只小鼠），随后颈椎脱臼。根据机构动物护理和使用委员会，CO <2>必须在a 以每小时10-30％体积排量的低流速控制分钟。
2. 用酒精擦拭腹部后，做腹部切口。使用镊子和剪刀仔细清除整个结肠（图1）。从盲肠切到肛门（8-10厘米之间，取决于 ?小鼠大小），并将其放置在具有15ml冷PBS的10cm培养皿中 ?覆盖结肠。
3. 保持结肠的远端部分镊子和冲洗去除粪便与5-10毫升冷无菌PBS使用a 25 G针连接到5ml注射器。冲洗出粪便后，放置清洁的结肠在一个新的培养皿中用10毫升冷PBS
4. 在结肠纵向切口，用冷PBS再次冲洗，以清除残留的粪便
5. 将开放的结肠放在冷的HBSS培养基在冰上，直到所有的冒号 ?如在步骤A1-4中那样提取实验。对于好的单元格产量，我们在每个测试条件下使用三只小鼠
6. 将所有结肠孵育在含有100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的5ml HBSS中（室温15分钟）。
7. 剁碎结肠组织成小块约。 2mm×2mm ?培养皿，在手术刀的帮助下。把小块放在50 ml Falcon管中，并在5ml的8mM EDTA的HBSS（160μl0.5M）中孵育 EDTA在10ml HBSS中; 15分钟，37℃）
8. 取出培养基，加入5 ml新鲜冷HBSS到猎鹰管底部的结肠碎片。
9. 通过剧烈手摇分离隐窝上皮细胞以获得 ?富集隐窝的上清液。从组织碎片上清液 ?进入新的Falcon 50ml管中。向样品中加入新鲜冷HBSS 重复摇动步骤。重复此过程3-5次增加地穴富集
10. 为了确认隐窝分离，在显微镜下观察20μl上清液样品（图2）。
11. 离心上清液（200×g/g，15分钟，4℃）
12. 除去上清液。向沉淀中加入5ml的解聚培养基，将其转移到15ml Falcon管中并孵育（30分钟，37℃ ?以2500rpm，轨道振荡） ?单细胞悬液。
13. 解聚后，向培养基中加入250μlFBS（终浓度5％）以终止分散酶反应
14. 依次通过100μm纱布，70和40μm细胞过滤器过滤细胞
15. 通过离心（150×g，10分钟，4℃）收集细胞，重悬于1.5ml染色缓冲液（PBS中的2％FBS）并计数活细胞 ?在细胞计数器中。来自三只小鼠的预期细胞产量为约。 2 ?x 10 ⁷ cells。
16. 染色1×10 6个肠道隐窝细胞荧光标记的抗体对感兴趣的细胞标记物标准FACS分析程序，并在流式细胞仪上分析。
流式细胞分析的实例
1. 在200μl染色缓冲液（2％）中孵育1×10 6个肠道隐窝细胞， FBS在PBS中）与荧光标记的抗CD45，-CD4，-F4/80，-CD8和 ?-Ly6G抗体（20分钟，4℃，避光）。稀释抗体。 4-CD45-APC，稀释1/100; CD4-FITC稀释1/100; F4/80-稀释1/200的生物素;稀释1/200的CD8-PeyC7和稀释的Ly6G-PE ?1/100。
2. 用150μl染色缓冲液洗涤两次，离心（150×g，5分钟，4℃）并弃去上清液。
3. 孵育细胞与稀释1:50（20分钟，4°C，避光）链霉亲和素
4. 重复洗涤步骤B2。
5. 将细胞重悬在200μl染色缓冲液中，并转移到具有220μl染色缓冲液的圆底流式细胞仪管中。
6. 使用Kaluza程序分析染色，对CD45 +细胞中的每种抗体门控所有阳性细胞（图3）。

代表数据

图1.结肠分离的顺序图像按照文本中所述顺序获取图片。

图2.小鼠结肠隐窝的光学显微镜图像。将20μl含有隐窝的悬浮液与玻璃盖玻片一起直接放置在玻璃目标载玻片上。使用10x和40x物镜和连接到显微镜的数码相机获取图像。在右图中示出了以虚线平方表示的场的更高放大率。地穴是单个或群集的细长柱状和球形细胞

图3.小鼠结肠中CD45 +细胞的表征。小鼠的结肠crypt细胞用抗CD45，-CD4，CD8，-Ly6G和-F4/80染色抗体和通过流式细胞术分析的阳性细胞的百分比。显示了代表性的曲线。其他FACS分析和定量图像实例在Cancer Research（Del Reino等人，2014）中公开。有关详细信息，请参阅图5B。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 2.7mM KCl
4.3mM Na 3 PO 4 4/v/v 1.4mM K 2 HPO 4
分解介质
HBSS
0.4 mg/ml分泌酶
青霉素/链霉素：100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素

致谢

这项工作由西班牙经济和竞争力部（MINECO）（SAF2013-45331-R）和LaMaratóTV3基金会（82031）支持。

参考文献

Clevers，H.（2013）。肠道隐窝，原型干细胞区室细胞 154（2）：274-284。
Del Reino，P.，Alsina-Beauchamp，D.，Escos，A.，Cerezo-Guisado，MI，Risco，A.，Aparicio，N.，Zur，R.，Fernandez-Estevez，M.，Collantes，，Montans，J。和Cuenda，A。（2014）。替代p38丝裂原活化蛋白激酶p38gamma和p38delta的致癌作用，连接炎症和癌症结肠炎相关的结肠癌。 Cancer Res 74（21）：6150-6160。
Mowat，A.M.和Agace，W.W。（2014）。肠道免疫系统内的区域专业化。 Nat Rev Immunol 14（10）：667-685。