材料和试剂

孔径为0.22μm的无菌过滤器（Merck Millipore Corporation，Millex -GV Filter unit，目录号：SLGV033RS）
50ml注射器（TERUMO CORPORATION，目录号：SS-50ESZ）
12孔板（Sumitomo Bakelite Co.，目录号：MS-80120）
Erwinia carotovora subsp。 carotovora（国立技术与评估研究所，目录号：103133）
稳定表达GFP-VAM3（RIKEN Bioresource Center，目录号：RPC00039）的转基因烟草BY-2细胞培养物（紫um um
Aphidicolin（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：015-09814）
酵母提取物（KANTO KAGAKU，KANTO Chemical，目录号：712021-5）
胰蛋白胨（BD bioscience，目录号：211705）
NaCl（KANTO KAGAKU，KANTO Chemical，目录号：37144-01）
Murashige和Skoog植物盐混合物（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：392-00591）
蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：196-00015）
肌醇溶液（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：094-00281）</em>
盐酸硫胺素（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：201-00852）
2,4-二氯苯氧基乙酸钠一水合物（Tokyo Chemical Industry，目录号：D1319）
溶菌酶培养基（LB）培养基（参见配方）
修改的Linsmaier和Skoog（LS）介质（参见配方）

设备

旋转振荡器。 carotovora 文化（TAITEC CORPORATION，型号：BR-40LF）
300ml烧瓶中。 carotovora 文化（Sansyo，Iwaki，目录号：82-0087）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 640）
离心机（TOMY SEIKO CO，型号：MX-300）
深冷冻器（Nihon Freezer，目录号：CLN-30U）
100ml培养瓶（Sansyo，Iwaki，目录号：82-0085）用于BY-2培养
用于未处理的BY-2培养物（TAITEC CORPORATION，目录号：300LF）的旋转振荡器
用于处理的BY-2培养物（TAITEC CORPORATION，目录号：NR-30）的旋转振荡器
用于处理的BY-2培养物（Sanyo，目录号：MIR-553）的培养箱
玻璃底皿（Sansyo，Iwaki，目录号：3911-035）
共聚焦激光扫描显微镜（OLYMPUS，型号：FV300）

程序

E的制备。 carotovora 培养滤液
1. 培养100毫升E。 carotovora）在液体LB培养基中在37℃下在旋转振荡下在150rpm下培养过夜。
2. 用分光光度计检查OD <600>。对于明显的细胞死亡诱导，OD <600>值应该在0.8-1.0的范围内
3. 在室温下以4,000×g离心细菌细胞培养物10分钟
4. 收集上清液，用注射器过滤器无菌过滤
5. 滤液可在-80℃下在深冷冻箱中保存几个月。
滤液对细胞周期同步的烟草培养细胞的应用
1. 准备S期同步转基因BY-2细胞表达 GFP-VAM3通过DNA聚合酶抑制剂（aphidicolin）处理和洗涤用新鲜的改性LS培养基（Nagata和Kumagai，1999; Kumagai-Sano et al。，2006）。
2. 刚洗完后，放30 ml 的同步培养细胞在旋转振荡器上的100-ml烧瓶中在27℃下以130rpm培养30分钟
3. 将1.6ml细胞周期同步培养物加入12孔板的孔中
4. 加入0.4ml的E。 carotovora 培养物滤液进入细胞培养孔[最终浓度：20％（v/v）]。
5. 将处理的细胞在27℃的培养箱中的旋转振荡器上培养2小时
6. 收集150微升的细胞进入显微镜玻璃皿基地观察。
7. 将盘放在共焦激光扫描显微镜的平台上。
8. 获得GFP-VAM3的延时图像与488 nm 5分钟间隔 ?激发激光器和524-546nm发射滤光器显微镜制造商的说明。代表性见图1 结果。

代表数据

GFP-VAM3的代表性延时图像显示在图1中。在滤液处理之后，包括跨越血管的内陷液泡膜结构逐渐减少（图1）。在透析治疗后4小时，经透子线无细胞细胞的百分比达到12.8±3.00％，而在模拟处理中为1.52±1.48％（Hirakawa等人，2015）。

图1.用表达绿色欧文氏菌的培养物滤液处理的表达GFP-VAM3的烟草BY-2细胞的延时观察。注意，内陷的液泡膜在细胞死亡之前逐渐减少具有细胞收缩。以5分钟间隔获得延时图像4.5小时。比例尺表示50μm。

笔记

你应该等待大约10分钟后，显微镜玻璃皿基地放置在显微镜载物台上开始时间推移成像。在等待期间，细胞将完全沉降到底部，导致没有细胞位移的理解的结果。

食谱

LB培养基
注意：无需调整pH值。

酵母提取物
5 g/L

Bacto ^TM胰蛋白酶
10 g/L

NaCl
5 g/L

修改的LS培养基

Murashige和Skoog植物盐混合物	4.6 g/L
蔗糖	30 g/L
myo - 肌醇溶液	200 mg/L
盐酸硫胺素	1 mg/L
2,4-二氯苯氧基乙酸	0.2 mg/L
用KOH调节pH至5.8，

致谢

作者感谢Toshihisa Nomura博士进行初步实验。 carotovora 培养物滤液。该工作由JSPS KAKENHI批准号25711017（T.H。），25291056（S.H。）和24114007（S.H。）支持。

参考文献

Hirakawa，Y.，Nomura，T.，Hasezawa，S.and Higaki，T。（2015）。在植物细胞死亡过程中，通过 Erwinia carotovora的培养物滤液引发的液泡结构的简化 >。
Kumagai-Sano，F.，Hayashi，T.，Sano，T.and Hasezawa，S。（2006）。烟草BY-2细胞的细胞周期同步。 Nat Protoc < （6）：2621-2627。
Kutsuna，N。和Hasezawa，S。（2002）。在同步烟草BY-2细胞的细胞周期进程中，液泡和微管结构的动态组织。 a> 植物细胞生理 l 43（9）：965-973。
Nagata，T.and Kumagai，F。（1999）。通过高度同步的烟草BY-2细胞系窗口的植物细胞生物学。 Methods Cell Sci 21（2-3）：123-127。