材料和试剂

材料和试剂1。锥形管（50ml）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）
Miracloth（Calbiochem ^?，目录号：475855）
注意：目前，它是"默克密理博公司，目录号：475855"。
标签胶带（三叶草，目录号：ST20）
纸毛巾
行和 Hpa 隔离。 Ws-2 ems1-1突变体[先前报道为Ws-0的登录实际上是Ws-2（Parker等人，1996）]和Col-0植物分别用作Hpa 分离株Emoy2的拟南芥的易感和抗性登录。
乙醇（70％）
塑料托盘（270 x 270 x 60毫米），带有透明盖子
无菌水
Bright-Line TM血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
苯酚（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：160-12725）
水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：C8383）
甘油（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：07500616）
台盼蓝溶液（见配方）
水合氯醛溶液（见配方）

设备

剪刀
生物安全柜（Labconco，型号：净化器Delta系列II类A2型）
喷枪套件（Airtex，型号：ASCF4和KIDS105）
生长室（NKsystem）（Nippon Medical& Chemical Instruments Co.，目录号：LPH410S）
重量（Sartorius，型号：Quintix 224-1S）
水浴（NE1-8）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11459499）
Labo摇动器（BIO CRAFT，目录号：BC730）
立体显微镜（Leica Microsystems，目录号：M165FC）

程序

接受 Hpa
1. 使用70％乙醇消毒剪刀和生物安全柜内。
2. 打开一个带有透明盖子的塑料托盘，其中含有被孢子囊磷脂密集覆盖的拟南芥植物（图1A）生物安全柜，以避免分生孢子扩散注意： ?检查Hpa的不同分离物的污染，使用两者易感和抗性拟南芥品种繁殖的Hpa （图1A）。
3. 在50ml锥形管中收获拟南芥植物的天花部分（图1B）。
  注意：在管上加入最多20ml的组织标记（参见图1B）。避免任何土壤污染，因为它可能导致土壤的传播居住的病原体。
4. 将15毫升无菌水放入50毫升锥形管中，轻轻摇动几次，得到孢子囊水溶液。
5. 使用Miracloth过滤所获得的悬浮液（图1C）
6. 使用a测量悬浮液中分生孢子的浓度 ?血细胞计数器（图1D），并用水稀释至浓度为5 ?x 10 ⁴分生孢子/ml水注意：要了解如何计数血球计，请检查链接（ http：//www.hemocytometer.org/ ）。
7. 使用喷枪套件通过喷雾使拟南芥植物悬浮。
  注意：通常使用2周龄的植物和5天龄的幼苗通过计数分生孢子和计数评价Hpa生长孢子囊菌。使用2周龄植物 Hpa的传播。拟南芥植物在22℃和60％湿度在10小时光周期内环境控制生长机柜。
8. 将接种的植物放在一个塑料托盘中透明盖保持高湿度（90-100％）条件（图 1E）。
  注意：高湿度对于Hpa的生长非常重要。从而，使用标签带密封带有透明盖的塑料托盘 ?推荐。
9. 在生长室中在16℃，10小时光照下孵育接种的Hpa 接种植物，直到采样日为止。
  注意：取样的时间取决于Hpa分离物的组合和拟南芥（Arabidopsis）种质。通常，从4到7天后接种将是适当的时机。
  
  图1.过程接种Hpa 。 A.接种Hpa后7天的拟南芥的敏感和抗性登录。 Ws-2 eds1-1 突变体以前报告为Ws-0的登记事实上是Ws-2; （Parker等人， 1996）和Col-0植物用作敏感和抗性种质 ?的分离物Emoy2的拟南芥。红色箱子：特写镜头 ?如下图所示。 B.在50ml中收获的拟南芥植物锥形管。 C.过滤所得悬浮液的说明使用Miracloth。 D.血细胞计数器上分生孢子的图像。红箭头表示分生孢子。比例尺=200μm。 E.塑料托盘其具有包含接种了拟南芥植物的 Hpa 接种的植物的透明盖。
通过计数分生孢子对hpa 生长的评价
1. 用无菌水在50ml锥形管中收获接种的Hpa 接种植物的地上部分。
  注意：每个重复的复制数和植物数取决于 ?实验设计。通常，我们收获5个池，每个池的3株植物在1ml水中（总共15株植物）拟南芥系。
2. 涡旋锥形管。
3. 使用血细胞计数器计数在水中释放的分生孢子的量（见图1D）
4. 用纸巾擦干植物，并测量其鲜重注意：Hpa的生长表示为每孢子孢子数 ml水每克鲜重（分生孢子ml ^-1 ^{/sup> FW）。的疾病症状的强度（分生孢子数）是可变的，取决于几个条件，如湿度，强度光，接种时间和宿主植物的年龄。条件可以 ?在每个实验中通过放置所有植物材料来控制（例如WT和所有研究的突变体）感染。}
通过在台盼蓝染色之后计数孢子生成来评价Hpa 生长注意：所有步骤都应使用防护服，因为台盼蓝溶液和水合氯醛是高毒性化学品。
1. 在50ml锥形管中收获Hpa 接种的幼苗的空间部分并用台盼蓝溶液覆盖收获的幼苗注意：每个调查行至少要采集50个子叶。
2. 在通风橱中的水浴中煮沸1分钟。
3. 在室温下孵育1小时。
4. 用水合氯醛溶液替代台盼蓝溶液，在室温下在Labo摇床上放置过夜
5. 用60％甘油代替水合氯醛溶液。
6. 使用立体显微镜计数每个子叶的孢子囊数目
  
  图2. Typan蓝色染色的子叶。抗性（左）和接种后7天的拟南芥的易感（右）种质与 Hpa 。使用Col-0植物（左）和Ws-2 eds1-1突变体（右）作为拟南芥分离物的抗性和易感种质 Emoy2。黄色箭头表示过敏反应（HR），通常与植物相关的程序性细胞死亡抗病性。红色箭头表示孢子囊菌。

食谱

台盼蓝溶液
10ml乳酸
10ml甘油 10克酚
10ml无菌水
10mg台盼蓝
通过用乙醇（1:1v/v）稀释上述溶液并在室温下储存来制备工作溶液。
水合氯醛溶液
向瓶中加入约200ml无菌水和500g水合氯醛，在通风橱中搅拌过夜

致谢

我们的工作得到了盖茨比基金会的支持（ http://www.gatsby.org.uk/），JSPS KAKENHI 15K18651（SA）和24228008（KS）和RIKEN特殊博士后研究奖学金（SA）。我们感谢Timothy Westlake对手稿的帮助。

参考文献

Asai，S.，Rallapalli，G.，Piquerez，S.J.，Caillaud，M.C.，Furzer，O.J.，Ishaque，N.，Wirthmueller，L.，Fabro，G.，Shirasu，K.and Jones，J.D。（2014）。在阿拉伯芥中表达谱分析 /霜霉病相互作用揭示了高度表达的效应子其减弱对水杨酸的反应。 PLoS Pathog 10（10）：e1004443。
Coates，M.E。和Beynon，J.L。（2010）。 Hyaloperonospora Arabidopsidis 作为病原体模型。 Annu Rev Phytopathol 48：329-345。
Holt，B.F.，3rd，Belkhadir，Y。和Dangl，J.L。（2005）。抗病性控制植物免疫系统中的抗病性蛋白质稳定性。 309（5736）：929-932。
Parker，J.E.，Holub，E.B.，Frost，L.N.，Falk，A.，Gunn，N.D。和Daniels，M.J。（1996）。 eds1的表征，在拟南芥中突变，抑制对寄生霜霉菌的抗性通过几个不同的RPP基因。植物细胞 8（11）：2033-2046。