材料和试剂

细菌细胞培养
乙酸乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：34972-1L-R）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：45754-100ML-F）
盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：H1758-100ML）
原卟啉IX（Frontier Scientific，目录号：P562-9）
粪卟啉III二氢氯化物（Frontier Scientific，目录号：C-654-3）
甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：14265-1ML）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：34967-250ML）

设备

对于卟啉提取

超声波仪（Fisher Scientific，型号：550声波破碎仪）

对于LC/MS/MS分析

5500 QTRAP LC/MS/MS系统（AB Sciex）
1200系列HPLC系统（Agilent Technologies）
脱气自动进样器（Agilent Technologies）
二元泵（Agilent Technologies）
Zorbax SB-Aq柱（4.6×50mm，5μm）（Agilent Technologies，目录号：846975）

程序

对于卟啉提取（改编自Nakayashiki和Inokuchi，1997）

培养细菌细胞，直至最终细胞悬浮液相当于100ml，A 600为0.4
通过在4℃下以7000xg离心10分钟收获细胞并在20ml预冷的0.05M Tris pH 8.2-2mM EDTA中洗涤沉淀
将细胞重悬在10ml相同的缓冲液中。
测量培养悬浮液的A 600，并通过加入Tris-EDTA缓冲液调节以平衡每个样品的A 600。
在4℃下以7,000×g离心细胞10分钟。将细胞沉淀重悬在1ml乙酸乙酯/乙酸（3：1，v/v）中
在冰上用电源3超声处理细胞2分钟以裂解细胞
通过在4℃下以7000xg离心10分钟除去细胞碎片，然后将上清液转移到新管中。
加入1ml H 2 O，涡旋，并以7000xg离心5分钟。取出并丢弃含水顶层。
重复步骤8.
加入100μl的3M盐酸溶解卟啉
在转移上层之前，在剧烈涡旋之后离心 ?含有水溶性卟啉到新鲜的Eppendorf管中

对于LC/MS/MS分析

用Zorbax SB-Aq色谱柱进行LC分离
1. 使用0.1％甲酸的水溶液作为流动相A和0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B.
2. 使用0.3ml/min的流速。
3. 进行如下逐步洗脱：0-1分钟100％A，然后逐渐降低到5％A，直到最小10.保持5％A，直到最小18 ?然后增加到100％A直到最小19.保持100％A直到结束（分钟24）。
4. 将自动进样器设置在5°C。
5. 从上述步骤11注入样品（1μl）。
用正电喷雾电离（ESI）获得质谱，离子喷雾电压设置为5,500 V.
1. 将源温度设置为450°C
2. 将窗帘气体，离子源气体1和离子源气体2分别设置为32,65和50
3. 使用多反应监测（MRM）监测粪卟啉 III（m/z 655.4-> m/z 596.3）和原卟啉IX（m/z 563.2-> ?m/z 504.1）。使用1μg卟啉标准品进行初始测试。
使用Analyst 1.6测量所得色谱图的峰面积。
请注意，这是一个定性评估。使用标准曲线需要相应的卟啉参考以获得绝对值。

代表数据

图1.原卟啉IX的MRM色谱图。原卟啉IX在H 2 O 2亚型应激细胞中的细胞内积累（Hpx2 ）由于缺少hemH 激活而加剧[Hpx2 ^- hemH （NI）]。包括1μg原卟啉IX作为参考标准

图2.粪卟啉III的MRM色谱图。细胞内粪卟啉原III在缺乏hemF - ΔhemF），其水平与在缺乏粪卟啉原III氧化酶同功酶（ΔhemNΔhemF）的细胞中检测到的水平相当。包括1μg粪卟啉III作为参照标准。

笔记

暴露于空气中时，所有卟啉原自动氧化成卟啉。因此，可以通过LC/MS/MS分析和定量粪卟啉III和非粪卟啉原III（两种粪卟啉原III氧化酶同工酶HemN和HemF的实际底物）。类似地，原卟啉原IX，血红素生物合成途径的倒数第二个酶的底物，即原卟啉原IX氧化酶，自发地氧化成原卟啉IX。因此，原卟啉IX水平应反映原卟啉原IX和原卟啉IX的总和。

致谢

这项工作得到国家卫生研究院授予GM49640和来自瑞士国家科学基金会的奖号PBBEP3_139397的支持。卟啉提取的方案改编自Nakayashiki和Inokuchi（1997）。

参考文献

Mancini，S。和Imlay，J.A。（2015）。两种生物合成酶的诱导有助于大肠杆菌维持血红素合成和激活过氧化氢酶在过氧化氢胁迫过程中的作用。 Mol Microbiol 96（4）：744-763。
Nakayashiki，T。和Inokuchi，H。（1997）。饥饿对血红素对大肠杆菌中卟啉合成的影响。 Mol Gen Genet 255（4）：376-381。