材料和试剂

96孔黑色底板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655209）
抗人Fc捕获生物传感器（Pall Corporation，ForteBio ，目录号：18-5060）
磷酸盐缓冲盐水（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：100-10023）
单克隆抗体和高糖基化核心分析物（内部表达）

设备

Octet Red系统（Pall Corporation，ForteBio ，部件号：30-5048）

软件

数据分析6.2评估软件（Forte Bio）

程序

生物传感器是用专有的生物相容性基质包被的末端，其可以以最小的非特异性结合结合人免疫球蛋白的Fc区。在单独的黑色底板中，在实验前将生物传感器在室温下在200μlPBS中水合10分钟。根据图1所示的模板产生样品板。用200μlPBS填充缓冲液孔。将选择的单克隆抗体在PBS中以5μg/ml稀释，并以200μl的体积分配到如模板所示的加载柱的每个孔中。用200μlPBS填充H1孔。在单独的平板中，分析物（HIV包膜核心糖蛋白用于图1所示的实例中）在PBS中以1μM至31.25nM开始连续稀释2倍，并在200μl体积中转移到模板如图所示（图1）。然后将传感器板（具有生物传感器的板）和样品板（具有其它试剂的板，如图1所示）插入Octet Red机器中，并如下进行基本动力学测量实验：

将传感器浸入缓冲液中用于平衡。
将传感器转移至传感器板，并在1,000rpm下在传感器上捕获单克隆抗体60秒。
在PBS中洗涤传感器，在1,000rpm下获得稳定的基线60秒。
将抗体固定的传感器浸没在含分析物的孔中，在1,000rpm下600秒，以允许分析物与给定的单克隆抗体的潜在缔合。
然后将生物传感器转移至含有体积为200μlPBS的孔中，并以1,000rpm浸渍于600秒以解离结合的分析物。
在每次运行期间，包括两个参考传感器，首先，在关联步骤，将传感器浸没在作为分析物对照的PBS缓冲液中（用于在原始数据分析期间进行减法），其次，其中没有抗体固定在传感器上，在结合期期间使用500nM分析物以评估分析物与抗人Fc捕获传感器的非特异性结合的水平（如果检测到任何这样的相互作用）。
使用Data Analysis 6.2评估软件分析数据。使用分析物对照参考孔处理数据以从实验数据曲线中减去，将Y轴与基线对准，并应用Savitzky-Golay作为过滤过程。接下来，使用1:1模型和全局全曲线拟合来绘制缔合和解离响应曲线，以计算K sub，K d和K D，/sub>值。

图1.样品板和通过生物层干涉测量（BLI）的动力学实验的代表性数据的示意图。 A。用于测量单核体抗体与其配体之间的结合相互作用的动力学的样品板设置。 REF 1孔用PBS填充并用于参考减除。 REF 2孔是检查分析物与Fc捕获传感器的非特异性结合的对照实验。 B.在各种分析物浓度下广泛中和性HIV 1单克隆抗体与稳定的核心包膜蛋白的结合动力学。黑线代表通过1：1结合动力学产生的理论Langmuir拟合。彩色线是结合事件的缔合和解离的实验曲线

致谢

此协议以前用于Ingale等人（2014）。

参考文献

Ingale，J.，Tran，K.，Kong，L.，Dey，B.，McKee，K.，Schief，W.，Kwong，P.D.，Mascola，J.R.and Wyatt，R.T。设计用于呈递CD4结合位点的高糖基化稳定核心免疫原优先被广泛中和抗体识别。 a> J Virol 88（24）：14002-14016。