材料和试剂

10ml聚丙烯管16×95mm（Deltalab，目录号：400900）
5ml超速离心管13×51mm（Beckman Coulter，目录号：326819）
1.5 ml螺帽瓶32 x 11.6 mm
7.5ml螺旋盖管13×100mm
Wistar大鼠肝脏
盐水溶液（Laboratorios ERN，目录号：999790）
蛋白标准品（2mg BSA）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：P5619）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：P5619"。
Na 2 CO 3（EMD Millipore Corporation，目录号：106392）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：209198）
酒石酸钾钠四水合物（Sigma-Aldrich，目录号：217255）
Folin-Ciocalteu的酚试剂（EMD Millipore Corporation，目录号：109001）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：60229）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：60229"。
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，Falcon ，目录号：56814）
KCl（EMD Millipore Corporation，目录号：104936）
乙二胺四乙酸二钠盐-2水合物（EDTA）（Riedel-deHa?n，目录号：34549）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，FLUKA，目录号：34549"。
蔗糖（BD Biosciences，Falcon ，目录号：84100）注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：84100"。
（AppliChem GmbH，目录号：122333）
奈韦拉平（Viramune）（Boehringer Ingelheim）
甲醇，用于HPLC-梯度级的HiPerSolv CHROMANORM（VWR International，Prolabo，目录号：20864.320）
二甲基亚砜（DMSO）（最小99.5％GC，测试的植物细胞培养物）（Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
盐酸去甲替林，最少98％TLC（Sigma-Aldrich，目录号：N7261）
D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G7250）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐（β-NADP）（Sigma-Aldrich，目录号：93205）
来自肠膜明串珠菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：G5760）
适合于细胞培养的适于昆虫细胞培养的生物试剂（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）的MgCl 2·6H 2 O，BioReagent，
乙腈（VWR，Prolabo，目录号：83639.320）
汇集来自50个不同个体供体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：HMMCPL）的人肝微粒体}
氢氧化钠（超纯的颗粒）（Scharlab，S.L。，目录号：SO0420005P）
乙酸乙酯（超纯）（Scharlab，S.L。，目录号：AC01431000）
2（Guinama，目录号：90790）。
三乙胺（Sigma-Aldrich，目录号：T0886）
50 mM磷酸钠 - 钾缓冲液（见配方）
0.1 M磷酸钾缓冲液（见配方）
Lowry试剂（参见配方）
50 mM磷酸二钠缓冲液（见配方）

设备

外科工具
剪刀
分光光度计（Hitachi High-Technologies Corporation，型号：U-2900）
1cm聚苯乙烯分光光度计比色杯（Sigma-Aldrich，目录号：C5219）
恒温水浴
冷冻离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：2K15）
冷冻超速离心机（130,000rpm）（Beckman Coulter，型号：Optima ^TM MAX超速离心机）
Tissue Grinder，Potter-Elvehjem型，30ml玻璃容器和平柱塞（分别为VWR，Prolabo，目录号：432-0204和89026-400）

程序

在大鼠肝微粒体中去甲替林的奈韦拉平代谢的抑制
1. 按照以下步骤分离大鼠肝微粒体：
  1. 通过异氟醚吸入总共牺牲5只Wistar大鼠（280-310g）
  2. 打开每只大鼠的腹腔，切除肝脏，并将其放入含有盐水溶液的烧杯中
  3. 用盐溶液洗肝脏，并将其放在纸巾上。
  4. 称重肝脏，并在4°C切成小块
  5. 将肝脏放入玻璃容器中，加入其体积的5倍的50mM磷酸钠 - 钾缓冲液（pH 7.4），其含有1.15％（wt/vol）KCl，2mM EDTA和0.25M蔗糖
  6. 用组织研磨机匀化肝脏，直到获得完全均匀的溶液
  7. 将匀浆转移到10ml聚丙烯管中，并以9000×g离心10分钟（4℃）。
  8. 将上清液转移到超速离心管中，并在150,000xg下离心（4℃）1小时。
  9. 在0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中重悬微粒体沉淀。
2. 按照Lowry等人的方法（1951）确定微粒体蛋白浓度：
  1. 制备一系列稀释的2mg牛血清白蛋白的水溶液，使浓度为0.1至1mg/ml。
  2. 加入10 ml聚丙烯管100μl的每个稀释的标准品 ?或含有微粒体的样品和2ml的Lowry试剂。
  3. 在黑暗中室温孵育试管15分钟。
  4. 向管中加入200μlFolin-Ciocalteu的酚试剂（1/2，vol/vol）的水溶液。
  5. 在黑暗中室温孵育试管30分钟。
  6. 在1cm分光光度计比色杯中测量750nm处的吸光度。
3. 在含有以下化合物（每100μl）的1.5ml螺帽小瓶中制备混合物：
  1. 10μlNVP在水，甲醇和DMSO的混合物中的溶液 ?（终浓度：5μg/ml NVP，0.12％甲醇和0.08％DMSO）
  2. 将10μlNT水溶液（最终NT浓度为100,200， ?300，500,1,000,2,000,3,000和10,000ng/ml）或10μl的H 2 O在 ?控制的情况。
  3. 5μl20mg/ml葡萄糖-6-磷酸水溶液
  4. 5μl的20-mg/mlβ-NADP水溶液
  5. 10μl葡萄糖-6-磷酸脱氢酶水溶液（10IU/ml）
  6. 5μlMgCl 2水溶液（13.4mg/ml）
  7. 数量足以使100μl的0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）
  8. 先前分离的大鼠肝微粒体（相当于0.1mg 蛋白）。通过该添加，开始代谢反应
4. 在37℃水浴中孵育试管30分钟
5. 通过向试验瓶中加入100μl乙腈，在冰浴中终止反应
6. 在4℃下，以2000×g离心样品瓶5分钟。
7. 通过高确定上清液中NVP的量高效液相色谱（HPLC），使用C18柱和UV 检测器设置在240nm，如先前所述（Usach，，2014）。
人肝脏微粒体中去甲替林对奈韦拉平代谢物形成的抑制
1. 在含有以下化合物（每100μl）的7.5ml螺旋盖管中制备混合物：
  一个。 20μlNVP在水，甲醇和DMSO的混合物中的溶液 ?（终浓度为5μg/ml NVP，0.12％甲醇和0.08％DMSO） b。将20μlNT水溶液（最终NT浓度为100， 1,000和10,000ng/ml）或10μlH 2 O。
  C。 10μl20mg/ml葡萄糖-6-磷酸水溶液
  d。 10μl的20-mg/mlβ-NADP水溶液
  e。 20μl葡萄糖-6-磷酸脱氢酶水溶液（10IU/ml）
  G。量足以使0.2ml的0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）
  H。人肝微粒体（相当于0.2mg蛋白质）。加入后，开始代谢反应
2. 在37℃水浴中孵育试管30分钟
3. 在冰浴中通过加入25μl的2N终止反应氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯萃取NVP，其代谢物。
4. 摇动混合物，等待几分钟，直到两相完全分离
5. 将上清液转移到另一个7.5螺旋盖管中，并在40℃水浴中在氮气流下蒸发。
6. 重复萃取：加入3ml乙酸乙酯，摇动试管，如前所述蒸发上清液
7. 将干燥的残余物溶解在100μl的流动相中的乙腈和磷酸二氢钠缓冲液（50mM [pH4.6]）含有0.1％（vol/vol）三乙胺（12/88，vol/vol）
8. 在4℃下，以2000×g离心样品瓶5分钟。
9. 确定上清液中NVP及其代谢物的量液相，使用设置在240nm的C18柱和UV检测器，（Usach，，2014）。

代表数据

图1.大鼠肝微粒体（NVP5μg/ml）中NVP代谢的代表性HPLC-UV色谱图。 A.NVP标准（无代谢）。 B.在37℃下30分钟后的NVP; C.NVP和NT（10μg/ml）在37℃下30分钟后

图2.人肝微粒体（NVP5μg/ml）中NVP代谢的代表性HPLC-UV色谱图。 A。 NVP标准（无代谢）; B.在37℃下30分钟后的NVP; C.NVP和NT（10μg/ml）在37℃下30分钟后。

笔记

用于分离大鼠微粒体的溶液和材料必须保持在冰上（4℃）。

食谱

50mM磷酸钠 - 钾缓冲液（pH7.4）[含有1.15％（wt/vol）KCl，2mM EDTA和0.25M蔗糖] 将102mg KH 2 PO 4与603mg Na 2 HPO 4混合物混合加入1.15g KCl，74mg EDTA和8.5g蔗糖将dH <2> O添加到100 ml
0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.4）将1.83g K 2 H 2 HPO 4+与3.27g KH 2混合物混合在一起> PO ₄
将dH <2> O添加到100 ml
Lowry试剂
将49ml试剂A与0.5ml试剂B和0.5ml试剂C：
混合试剂A：在0.1N NaOH中的2％Na 2 CO 3溶液
试剂B：在水中的1％CuSO 4+。在水中的H 2/H 2 O 试剂C：2％的酒石酸钾钠四水合物在水中
50mM磷酸钠一碱性缓冲液（pH4.6）[含有0.1％（vol/vol）三乙胺] 加入7.8g NaH 2 PO 4 .0H 2 2H 2 O和1ml三甲胺。
将dH <2> O添加到1 L
将pH调节至

致谢

该协议最近由Usach等人（2014）描述和应用。用于抑制测定的大鼠微粒体的分离和培养基的组成分别改变自Kawashima等人（1999）和Choi等人（2008）。从人微粒体提取NVP及其代谢物是从Erickson等人（1999）。 I. Usach已经被授予瓦伦西亚大学的人才培养计划（VLC-CAMPUS）的前行奖学金。

参考文献

Choi，Y.H.，Chung，S.J.and Lee，M.G。（2008）。 DA-8159，一种新的勃起功能药物和二甲双胍在大鼠中的药代动力学相互作用：代谢途径的竞争性抑制hepatic CYP3A1/2。 Br J Pharmacol 153（7）：1568-1578。
Erickson，D.A.，Mather，G.，Trager，W.F.，Levy，R.H。和Keirns，J.J。（1999）。人肝细胞色素的HIV-1逆转录酶抑制剂奈韦拉平的体外生物转化的表征P- Drug Metab Dispos 27（12）：1488-1495。
Kawashima，K.，Hosoi，K.，Naruke，T.，Shiba，T.，Kitamura，M.and Watabe，T。（1999）。镇静催眠，扎来普隆，猴子之间的肝脏代谢中的醛氧化酶依赖性标记物种差异大鼠。 Drug Metab Dispos 27（3）：422-428。
Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.and Randall，R.J。（1951）。使用Folin酚试剂进行蛋白质测量。J Biol Chem 193（1）：265-275
Usach，I.，Melis，V.，Gandia，P.and Peris，J.E。（2014）。大鼠中奈韦拉平和去甲替林之间的药代动力学相互作用：去甲替林对奈韦拉平代谢的抑制。 em> Antimicrob Agents Chemother 58（12）：7041-7048。