材料和试剂

无核酸酶1.5ml管（Sarstedt，目录号：72692005）
RNAlater（Life Technologies，目录号：AM7020）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM ，目录号：AM7020" />
RNAlater中的FACS分选的CD8 + sup/+ T细胞（Koning等人，2013）
T细胞标记物CD3（PerCP）（BD），CD8（AmCyan/V500）（BD）和pMHC-四聚体（APC/PE）（自制），以及倾倒标记物CD14和CD19（BioLegend， sup>?）
LIVE/DEAD活力染料（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM）
μMACSmRNA分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-075-201）
SMARTer Pico PCR cDNA合成试剂盒（Takara Bio Company，Clontech，目录号：634928）
dNTP各25mM（Life Technologies，目录号：R1121）
重组RNasin核糖核酸酶抑制剂20U /μl（Promega Corporation，目录号：N2511）
上标II RNA酶H 逆转录酶200U /μl（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18064014）
注意：此试剂盒还含有二硫苏糖醇（DTT，100 mM）。}
Nucleospin Extract II，凝胶和PCR清洗（MACHEREY-NAGEL GmbH& Co，目录号：MN740609.250）
分子级H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：W4502-1L）
Advantage 2聚合酶混合物（Takara Bio Company，Clontech，目录号：639201）
分子级琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher BioReagents ，目录号：10688973）
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies，目录号：S-11494）
注意：目前，"赛默飞世尔科技有限公司
1kb Plus DNA ladder（Life Technologies，目录号：10787-018）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM ，目录号：10787-01 > 8"。
pGEM-T Easy Vector System试剂盒I（Promega Corporation，目录号：A1360）
具有化学能力的大肠杆菌DH5α（自制）
AmpliTaq DNA聚合酶与缓冲液II（Life Technologies，目录号：N8080153）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM N8080153"。
Big Dye Terminator v3.1循环试剂盒（Life Technologies，目录号：4337455）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM ，目录号：4337455" br />
核糖核酸酶灭活剂（RNase Away）（MP Biomedicals）

引物（可从提供定制DNA寡核苷酸的任何公司订购）：

SMART II寡聚物	5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG * -3'
通用底漆长	5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
通用底漆短	5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
MBC2	5'-TGCTTCTGATGGCTCAAACACAGCGACCT-3'
M13转发	5'-TTTTCCCAGTCACGAC-3'
M13反向	5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
Oligo d（T）₂₅	5'-d（T）₂₅ VN ** - 3'

*该寡核苷酸中的最终GGG碱基是RNA碱基
** V = A，C或G. N = A，C，G或T
注意：最好订购高纯度的引物（HPLC纯化）。

10x通用底漆混合物（参见配方）
50 mM DTT（参见配方）

设备

FACSAria III流式细胞仪（BD）
加热块（42℃和70℃）（VWR International）
T-M-AR，DNA/RNA UV清洁盒（Laminair流动罩/UVC）（Biosan，目录号：BS-040104-A06）
标准台式Eppendorf离心机（在室温和4°C下使用）
PCR热循环仪

程序

FACS种类的抗原特异性T细胞
1. 在进行该方案的研究中，EBV和CMV特异性记忆使用pMHC I类四聚体在a上分离CD8 + T细胞群体 FACSAria III流式细胞仪。使用高保真染色策略， ?包括特异性T细胞标记物CD3，CD8和pMHC-四聚体，和转储标记CD14和CD19，以排除任何污染分别从单核细胞和B细胞分选。此外，LIVE/DEAD 活细胞染色被包括在细胞染色中。有关的详细信息特异性染色，参见Koning等人（2013）。四聚体阳性群体通常包含0.1-1.0％的CD8 + T细胞和一般分离500-5,000个抗原特异性细胞。
  注意：虽然特异性荧光染料用于Koning等人（2013），我们已经使用不同的荧光染料进行了sim染色策略 ?在其他研究。同样，虽然这个协议指定了分析EBV和CMV特异性T细胞，没有限制分析针对其他物种/抗原的T细胞。
  至获得完整和准确的TCR组成的视图抗原特异性T细胞群体，确保分选足够细胞数（至少500-1,000个细胞，理想地5,000个细胞或甚至）更多）高纯度（通过包括倾倒标记和活力染料，如上所述）。单元格直接在RNAlater和存储在-80°C。
mRNA分离
1. 使用μMACSmRNA分离试剂盒分离mRNA，根据制造商的说明。用30μl预热的洗脱缓冲液洗脱
2. 将mRNA储存于-80℃或进行cDNA合成。

cDNA生成

在70℃2分钟孵育5.5μlmRNA和0.5μlOligo d（T）25分（25mM），然后在42℃孵育2分钟。
注意：此步骤后尽可能快。时间可以赢在初始孵育期间制备下面的mastermix。理想情况下，准备混音的同时完成孵化。

添加：

2.2微升	5x第一串缓冲区	来自SMARTer cDNA合成试剂盒
0.4μl	DTT（50mM）
0.4μl	dNTPs（25mM）
1微升	SMART II Oligo（12μM）	从SMARTer cDNA合成试剂盒或定制*
0.5μl	RNasin（20U /μl）
1微升	SuperScript II Reverse Transcriptase（200 U /μl）

在42°C孵育2小时。
注意：*虽然定制的SMART II寡核苷酸可以降低成本，但它可以 ?表现小于包含在SMARTer cDNA中的寡核苷酸合成试剂盒。

cDNA纯化
使用Nucleospin Extract II凝胶和PCR清理工具包纯化cDNA。遵循制造商的协议，除了下面描述的。
添加到cDNA：
77μlH 2 O * 13μl缓冲液NTI
（总体积：100μl）
用650μl缓冲液NT3进行单次洗涤步骤就足够了。在25μl缓冲液NE中洗脱优选地，继续直接进行RACE（cDNA末端的快速扩增）TCRβPCR或将纯化的cDNA储存在-80℃。

RACETCRβ-PCR
使用TCR特异性和锚 - 互补引物进行RACE PCR。
准备所有试剂除模板外的PCR主混合物。准备足够的副本的每个样品和一个阴性对照（水代替模板）。克隆型组成的小的，人为的变化可以由PCR引起。因此，当需要非常准确地检测T细胞库（例如，在纵向分析中）时，建议进行在琼脂糖凝胶电泳（步骤5）后可以合并的重复PCR。

每个样本
5微升	10x Advantage 2 SA PCR缓冲液
10微升	10x通用引物混合物（正向引物）
1微升	MBC2（25μM，反向引物）
1微升	dNTPs（10mM）
1微升	50x Advantage 2聚合酶混合物
12微升	纯化的cDNA
20微升	H sub 2 O
50微升	总量

在热循环仪中在以下条件下进行反应：

1个周期	95°C	30秒
5个周期：	95°C	15秒
	72℃	2分钟
5个周期：	95°C	15秒
	70℃	30秒
	72℃	2分钟
30个循环：	95°C	15秒
	68°C	30秒
	72℃	2分钟
	4°C	∞

将TCRβ产品储存在-20°C 注意：不要在4℃保存，因为PCR产物的A突出端会随时间降解。

Vβ产物的分离
1. 在1％琼脂糖凝胶上电泳，使用1 kb DNA梯度确定片段的大小。在每个之间留下一个空的井样品以最小化交叉污染的机会。一个乐队在500-600 bp应该可见。仔细切除感兴趣的带和转移 ?将凝胶置于干净的1.5ml微量离心管中
2. 提取使用NucleoSpin Extract II凝胶从凝胶中扩增TCR产物和PCR Clean Up试剂盒，根据制造商的说明。将样品储存在-20°C。
  注意：执行额外的 sh步骤描述在协议和也使用预热（37℃）洗涤缓冲液 NT3。在20μl缓冲液NE中洗脱。

将Vβ产物连接到质粒和测序中
将扩增的TCR转录物连接到pGEM-T Easy载体中。使用5μl样品，7.5μl快速连接缓冲液，1μlpGEM-T Easy Vector和1.5μlT4 DNA连接酶制备15μl连接反应物。在4℃孵育过夜（16-24小时），然后使用7.5μl连接混合物转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细菌中。挑选96个单个转化的细菌克隆，使用M13引物扩增。每个样品使用以下PCR混合物（=每个细菌菌落）：

2.5μl	AmpliTaq PCR Buffer II
0.2μl	M13正向引物（25μM）
0.2μl	M13反向引物（25μM）
0.5μl	dNTPs（10mM）
0.125μl	AmpliTaq DNA聚合酶
3.0μl	MgCl 2（25mM）
18.475微升	H sub 2 O
25μl	总量

使用以下骑车条件：

1个周期	95°C	30秒
40个周期：	95°C	15秒
	57℃	30秒
	72℃	90秒
保持：	4°C	∞

评估在1％琼脂糖凝胶上的扩增效率。 Sanger测序使用Big Dye Terminator v3.1循环试剂盒进行，样品送至高通量设备，通过毛细管电泳进行测序。

代表数据

TCRβ-PCR的实施例：

图1.对3个不同供体进行重复TCRβ-PCR。使用1kb Plus DNA梯。正确的PCR产物长度为±550bp。注意除了所需的PCR产物的存在，这是SMART cDNA合成的常见副作用。

笔记

这个协议的成功取决于高质量的mRNA和"干净" 工作环境（DNase/RNase-free和PCR级的存在一次性用品）。污染必须最小化通过用10％漂白溶液和/或RNA酶灭活剂清洁。
除了差的mRNA质量/数量，许多因素可以导致PCR 失败。作为原因排除的更容易的因素之一是试剂 ?你使用。确保所有的库存清洁，准备正确，使用分子级水制备稀释液。此外，不要暴露试剂到室温的时间长于必要。
此外，使用新鲜的试剂。特别是SuperScript II Reverse 转录酶对于失去其随时间的活性敏感。理想情况下，所有试剂均小于一岁。而具有高输入的样本 RNA（例如，来自T细胞克隆的1.0×10 6个细胞）不遭受次优试剂，具有少量细胞的样品（500-5,000）对所使用的解决方案非常敏感。

食谱

10x通用引物混合物
准备含有0.4μM通用引物长和2.0μM通用引物短的混合物
50 mM DTT
用分子级H 2 O 1稀释100mM DTT储液（来自SuperScript II Reverse Transcriptase试剂盒）1：1

致谢

该方案改编自以前公开的研究（Douek等人，2002; Quigley等人，2011）。

参考文献

Douek，D.C.，Betts，M.R.，Brenchley，J.M.，Hill，B.J.，Ambrozak，D.R.，Ngai，K.L.，Karandikar，N.J.，Casazza，J.P.and Koup，R.A。（2002）。一种分析HIV特异性T细胞反应的特异性，克隆性和频率的新方法揭示一种用于控制病毒逃逸的潜在机制。 J Immunol 168（6）：3099-3104。
Koning，D.，Costa，AI，Hoof，I.，Miles，JJ，Nanlohy，NM，Ladell，K.，Matthews，KK，Venturi，V.，Schellens，IM，Borghans，JA，Kesmir，，DA和van Baarle，D。（2013）。 CD8 ⁺ TCR汇辑谱形成主要由抗原复合物。 J Immunol 190（3）：931-939。
Quigley，M.F.，Almeida，J.R.，Price，D.A。和Douek，D.C。（2011）。使用模板转换锚定的RT-PCR对T细胞受体表达的无偏分子分析。 rr Protoc Immunol