材料和试剂

A。（MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT，目录号：584），其中所述的菌株C58 nocc（胭脂碱分解代谢）
Arabidopsis thaliana Col-0
大肠杆菌（大肠杆菌）菌株MRF'（Agilent Technologies，目录号：200230-41）
Dynabeads Oligo（dT）25（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：61005）}
SMARTer RACE 5'/3'Kit（Takara Bio Company，Clontech，目录号：634859）
DreamTaq DNA聚合酶（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0701）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
pGEM -T Easy Vector Systems（Promega Corporation，目录号：A1360）
无针皮下注射器（5cc）（Terumo Medical Corporation，目录号：SS-05L）
皮下针（Terumo Medical Corporation，目录号：NN-2138R）
KB介质（参见配方）
Agromix缓冲区（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液A（参见配方）
洗涤缓冲液B（见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
2x结合缓冲液（参见配方）

设备

培养管13ml（SARSTEDT，目录号：62.515.028）
NanoDrop 2000c UV-Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000c）
高性能模块化立体显微镜，用于基于应用的定制MZ6（Leica Microsystems，型号：MZ6）
球磨机（RETSCH，型号：MM200）
热循环仪（Eppendorf，目录号：950000031）
MiniSpin ^?/MiniSpin ^?加离心机（Eppendorf，目录号：022620100）
MagneSphere Technology Magnetic Separation Stands（Promega Corporation，目录号：Z5342）

程序

冠状肿瘤诱导
1. A的过夜文化。从生长的菌落获得根癌土壤杆菌在KB琼脂平板上。将菌落转移到3-5ml KB液体中培养基在具有组装的两位置通风的13ml培养管中帽（位置1：盖轻轻推，通气）并孵育在旋转振荡器中在140rpm下在28℃下过夜
2. 隔夜。将根癌土细胞以8,000rpm离心1分钟悬浮于3ml agromix缓冲液中。在28℃培养悬浮细胞再次140rpm，保持2-3小时。 OD 600通过分光光度计测量 ?调节至OD 600 = 0.5。
3. 年轻花序茎（3至10厘米） ?的拟南芥在底部附近用5ml注射器注射两次次，在另一个垂直方向为两次（图1）。注射器针被完全注射通过茎。一滴 A。根瘤土细胞用于一次注射。
图1.拟南芥膨胀茎的示意图。用注射器在注射区（标记）注射年轻的花序茎。原始的拟南芥图片来自网站（ http：//www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Arabidopsis&lang=1 ）。
1. 茎总共注射8次，因此通常8个块 ?的肿瘤在接种后25天产生（图2）。的用手术刀和镊子在茎下从茎切下肿瘤解剖显微镜Leica MZ6和称重在天平。
图2. 拟南芥冠gall肿瘤。在接种后25天，从冠状动物的茎产生冠gall肿瘤。用手术刀和镊子切割肿瘤（用红色圆圈标记）并称重

Poly-A-mRNA提取
大约50mg冠gall肿瘤用于mRNA提取。通过与聚苯乙烯珠结合的寡核苷酸Poly-dTTP（25）分离聚-A-mRNA。使用Dynabeads Oligo- [dT] 25试剂盒

将植物组织在液氮中冷冻，并在室温下均化球磨机，然后加入1ml裂解缓冲液，样品为在室温下进一步匀浆1-2分钟，直到组织 ?完全裂解。将裂解物在10,000rpm离心30秒。
Dynabeads Oligo- [dT] 25试剂盒的制造商方案执行。将上清液与20μlDynabeads孵育30分钟 ?在室温下在顶置转子中。管子放在 MagneSphere ^?技术磁性分离器放置2分钟并取出 ?上清液。磁性架的制造商方案是 ?执行。
第一洗涤步骤：洗涤Dynabeads 用200μl洗涤缓冲液A洗涤两次，并用200μl洗涤缓冲液洗涤两次 ?B.磁体用于分离珠子和上清液洗涤。通过轻轻地冲洗Dynabeads的底部来洗涤管，直到所有珠子重悬浮，然后捕获珠子通过磁性架。除去上清液而不干扰珠子
为了排除DNA污染，mRNA是通过50μl洗脱缓冲液从珠子上洗脱并在75℃下孵育 2分钟。
第二个洗涤步骤：50μl2x结合缓冲液加入到洗脱的mRNA中，再次温育100μl混合物 20分钟，在室温下在顶置式振荡器中。
两后用200μl洗涤缓冲液B洗涤步骤，mRNA从洗脱液中洗脱 ?磁珠与22μl洗脱缓冲液在75℃下2分钟。的通过NanoDrop 2000c UV-Vis定量mRNA的浓度分光光度计。 mRNA直接用于第一链cDNA 合成用于5'RACE测定或储存在-80℃。

5'- cDNA末端快速扩增（5'RACE）测定
通过SMARTer TM RACE cDNA扩增试剂盒扩增致癌基因cDNA的5'末端。第一链cDNA由SMARTScribe TM逆转录酶产生并使用SMARTer II A寡核苷酸和5'-CDS引物A引发。

将下列试剂加入一个管中
2.75μl mRNA
1.0μl5'-CDS引物A
通过移液管将试剂充分混合，并在72℃下孵育3分钟，然后在42℃下孵育2分钟。
将下列试剂加到来自步骤a的混合物中，总体积为10μl
1.0μl         SMARTer II A寡核苷酸
2.0μl         5x First-Strand Buffer
1.0μl         DTT（20 mM）
1.0μl         dNTP Mix（10 mM）
0.25μl      核糖核酸酶抑制剂（40 U /μl）
1.0μl       SMARTScribe?反转录酶（100 U）
用移液管充分混合试剂，并在42℃下孵育试管90分钟
将反应混合物在70℃加热10分钟以终止反应 ?反应，并将第一链反应产物用10稀释折叠ddH 2 O。将样品储存在-20℃或用于下一步骤直。

癌基因cDNA 5'端的扩增和测序

通过扩增癌基因cDNA的5'末端的片段 DreamTaq DNA聚合酶，并使用通用引物A混合物（UPM）和特异性靶引物（表1），如以下反应所示混合物 PCR反应（总体积50μl）：
来自步骤3.3.1的cDNA                           1微升
5x缓冲区                                                 10微升
10x通用引物A混合                      5微升
特异性靶反向引物（10μM）      1微升
dNTP（10mM）                       ;                1微升
DreamTaq DNA聚合酶                 0.5μl
ddH ₂ O，最终卷为                ;    50微升
PCR程序：
步骤1：95°C                     1 min
步骤2：95°C                    30秒
步骤3：55°C                    30秒
第4步：72°C                    15秒
步骤5：重复步骤2-4 30个周期
步骤6：72°C                   5分钟
步骤7：4°C                      商店

表1.特异性癌基因反向引物

基因名（保藏号）	引物序列（5'→3'）
IaaH （pTiC58，AE007871）	CCCCGATTGCTAACAGACG
IaaM （pTiC58，AE007871）	CAAGAGTGTTCGAGAGG
Ipt （pTiC58，AE007871）	TCCCATGAATCAACTTAT

PCR产物通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化
将纯化的PCR产物通过TA克隆插入pGEM-T Easy Vector 2x快速连接缓冲液                      5微升
pGEM-T Easy Vector（50 ng /μl）     0.5μl
PCR产品                                     3.5μl
T4 DNA连接酶                                   1微升
通过移液管混合试剂，并在室温下孵育1小时
将得自步骤4c的重组载体转化进E。使用热休克法的大肠杆菌菌株MRF'。
对5个以上的独立菌落进行5'端测序 PCR产物，其是癌基因的转录起始位点。

代表数据

表2.癌基因启动子中的 Cis - 调节序列元件

该数据在PLOS Pathogens上发表（Zhang等人，2015）。正数表示下游的位置，负数表示TSS上游的位置（+1）。 TSS下划线。 Y = C/T，W = A/T，N = A/G/C/T。（Klee等人，1984）; （Nester et al。，1984）; （Goldberg等人，1984）; 4.（Heidekamp等人，1983）; （de Pater et al。，1987）; （Lichtenstein ed。，et al。，1984）

食谱

KB媒体
20克蛋白酶蛋白胨 1.5克K sub 2 HPO 4
0.87％甘油 600μMMgSO 4/v/v 15克琼脂（仅板）
高压灭菌器灭菌
Agromix缓冲区
0.01M MgCl 2/
0.01 M MES
pH 5.6
裂解缓冲液
100mM Tris-HCl（pH7.5） 500mM LiCl 10 mM EDTA
1％LiDS
5mM二硫苏糖醇（DTT）如果观察到任何沉淀，将缓冲液加热至室温并摇动，直至所有组分完全重悬
洗涤缓冲液A
10mM Tris-HCl（pH7.5） 0.15 M LiCl
1mM EDTA
0.1％LiDS
洗涤缓冲液B
10mM Tris-HCl（pH7.5） 0.15 M LiCl
1mM EDTA
洗脱缓冲液
10mM Tris-HCl（pH7.5）
2x结合缓冲液
20mM Tris-HCl（pH7.5） 1.0 M LiCl
2mM EDTA

致谢

我要感谢Rosalia Deeken（德国维尔茨堡大学分子植物生理学和生物物理系）对这项工作的监督和中国奖学金委员会（CSC）的财政支持。我还要感谢德国维尔茨堡大学分子植物生理学和生物物理学系高强高，帮助，建议和分享试剂。

参考文献

de Pater，B.S.，Klinkhamer，M.P.，Amesz，P.A.，de Kam，R.J.，Memelink，J.，Hoge，J.H.and Schilperoort，R.A。（1987）。土壤杆菌T-cyt基因的植物表达信号。 Nucleic Acids Res 15（20）：8267-8281。

Goldberg，S.B.，Flick，J.S.and Rogers，S.G。（1984）。根癌农杆菌的tmr基因座的核苷酸序列 pTi T37 T-DNA 。 Nucleic Acids Res 12（11）：4665-4677。

Heidekamp，F.，Dirkse，W.G.，Hille，J.and van Ormondt，H。（1983）。根癌农杆菌章鱼碱Ti质粒的核苷酸序列编码d tmr基因。 Nucleic Acids Res 11（18）：6211-6223。

Klee，H.，Montoya，A.，Horodyski，F.，Lichtenstein，C.，Garfinkel，D.，Fuller，S.，Flores，C.，Peschon，J.，Nester，E。和Gordon， 1984）。 pTiA6NC章鱼碱Ti质粒的tms基因的核苷酸序列：涉及植物肿瘤??发生的两种基因产物。 Proc Natl Acad Sci USA 81（6）：1728-1732。

Lichtenstein，C.，Klee，H.，Montoya，A.，Garfinkel，D.，Fuller，S.，Flores，C.，Nester，E.and Gordon，M。（1984）。 pTiA6NC章鱼碱Ti质粒的tmr基因的核苷酸序列和转录物作图：涉及的细菌基因在植物肿瘤发生中。 2（4）：354-362。

Nester，E.W.，Gordon，M.P.，Amasino，R.M.and Yanofsky，M.F。（1984）。冠gall - 分子和生理分析 Annual Review Of Plant Physiology And Plant Molecular Biology 35：387-413

Zhang，Y.，Lee，C.W.，Wehner，N.，Imdahl，F.，Svetlana，V.，Weiste，C.，Droge-Laser，W.and Deeken，在T-DNA转化的宿主植物细胞中调节癌基因表达。 PLoS Pathog 11（1）：e1004620。