材料和试剂

拟南芥根

注意：包含H. schachtii（合胞体）或南方根结线虫
乙醇
甲醛
焦碳酸二乙酯处理水（DEPC-H 2 O）
低熔点琼脂糖
培养皿（ 50 mm）
12/24孔板
parafilm
超能量
RNase Away（Thermo Fisher Scientific-Molecular BioProducts，目录号：7005）
DNase I，无RNA酶，HC（50U /μl）（50U/ul，1,000U）（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：EN0523）
RiboLock核糖核酸酶抑制剂（40U /μl）（RiboLock：40U /μl）（Thermo Fisher Scientic，Fermentas，目录号：EO0381）
乙二胺四乙酸（EDTA）
SuperScript TM反转录酶试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：18080-093）
脱氧核苷酸（dNTP）
牛血清白蛋白（BSA）
DIG（洋地黄毒苷-11dUTP-碱稳定; 25nmol /25μl）（Roche Diagnostics，目录号：11093088910）
BioTherm Taq DNA聚合酶（GeneCraft，目录号：GC-002-0100）
抗洋地黄毒苷-AP，Fab片段（150U /200μl）（Roche Diagnostics，目录号：11093274910）
/PBS/NBT液体基质系统（Sigma-Aldrich，目录号：B1911-100ML）中。
固定解决方案（参见配方）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
20x SSC（请参阅配方）
10x PCR缓冲液（参见配方）
10x洗涤缓冲液（见配方）

设备

Vibratome（Leica，型号：VT 100）
镊子
加热板
层流
PCR循环仪
立体显微镜

程序

注意事项：RNA非常敏感，容易被RNA酶降解！因此，始终戴手套，使用无RNase的水以及玻璃和塑料制品。推荐使用市售试剂从玻璃器皿或塑料制品表面消除RNase和DNA污染。 RNase离开！

固定
1. 切割含有H的饲养位点的拟南芥根部。 schachtii （syncytia）或 M。 incognita （嵌入痣中的巨细胞）和相应的未感染根段
2. 立即放将根块放入含有新鲜制备的微量离心管中和预冷的固定溶液，并在冰上真空渗透 15-20分钟以确保固定剂的适当渗透。孵化样品在4℃下在摇动器上轻轻摇动42小时或更长时间
嵌入
1. 随后在63％乙醇的PBS溶液中洗涤固定的样品3×10分钟，在PBS中洗涤1×10分钟
2. 将组织嵌入低熔点琼脂糖（5％w/v的PBS）的小置于加热板（35-40℃）上的培养皿（ 50mm）在里面层流。用镊子抓住根碎片，拭拭他们小心地用纸巾除去过量的PBS并将其浸泡进入平行于培养皿或12/24-孔底部的温热琼脂糖中板和约。在琼脂糖的一半深度。大约。 10根段/碟或1-2根段/12/24孔板（图1A）
3. 在层流中冷却琼脂糖。
4. 用石蜡膜密封的陪替氏培养皿可以在冰箱（4℃）中储存数周。
用vibratome和DNase处理的横截面的制备
1. 切出小琼脂糖块（约8毫米高×5毫米宽）含合胞体或未感染的根段与手术刀。修剪琼脂糖块在显微镜下（图1B）并胶合在圆上 vibratome板与一滴共同的superglue。生成交叉必须放置琼脂糖块中的根段垂直于振动板的底部（图1B-C）
  
  图1.将根片段置于12孔的孔内板（A;从上面看），修剪的琼脂糖块与根片段在垂直位置（B;从侧面看）和琼脂糖块胶合到振动板（C）上
2. 在填充有DEPC-H 2 O的vibratome托盘中切割20-25μm厚的组织切片。
  使用镊子（万一组织切片保留在琼脂糖部分）或移液管（在组织切片从琼脂糖切片）在表玻璃或类似物中收集切片容器，其填充有补充有RNA酶抑制剂的DEPC-H 2 O
3. 用移液管除去过量的DEPC-H 2 O（尽可能多的）。至防止非特异性DNA信号消化组织内的DNA 加入2微升无RNA酶的DNAse和1微升RNA酶抑制剂剩余覆盖横截面的DEPC-H 2 O 2。随后孵育样品在用石蜡膜密封的培养皿中的表玻璃中于37℃过夜。
洗涤
1. 加入几滴0.5 M EDTA，孵育横截面在65°C 10分钟灭活DNase。
  随后洗涤部分如下：
  用2x SSC缓冲液洗涤2次
  1次使用1x SSC缓冲区
  1次用0.5x SSC缓冲液
  用ddH <2> O 2次/2次每个步骤应当在密封的培养皿中在37℃下用1ml缓冲液或ddH 2 O进行10分钟。
反转录
1. 使用移液管（在约11.5μlddH 2 O）将几个部分转移到PCR管中。
2. 加入0.5μl3'引物和1.0μldNTP，并开始RT反应的第一步：65℃5分钟。
3. 冷却样品，在冰上孵育至少1分钟，加入4 μl5x第一链缓冲液，1μl0.1M DTT，1μlRNA酶抑制剂和1μlSuperScript ^TM Reverse Transcriptase。总体积20μl。
4. 在PCR循环仪中运行以下程序：
  25°C - 5分钟
  55°C - 1小时
  75°C - 5分钟（DNase失活）
PCR
1. 制备含有10mM dGTP，dATP和dCTP的dNTPs混合物。添加到RT-mix如下：
  5.0μl - 10x PCR缓冲液
  1.0μl-3'引物（终浓度0.5μM）
  1.0μl-5'引物（终浓度0.5μM） 1.0μl - dNTPs mix
  2.36μl - 2 mM dTTP
  0.5μl - DIG
  0.25μl-BioTherm ^TM Taq DNA聚合酶
  18.89μl-ddH 2 O
  总体积50μl（30μlPCR混合物和20μlRT-混合物）在阴性对照的情况下，聚合酶将被省略
清洗和检测
以下步骤在室温下在立体显微镜下进行（来自具有弱光源例如小台灯的暗室中的步骤G5）。在每个洗涤步骤之间可能需要短离心以收集PCR管底部的切片。该程序可以防止在几个洗涤循环期间意外移除组织切片。您还可以在每个清洗步骤后检查废弃的液体是否意外取出。
1. 用1×PBS缓冲液洗涤样品两次，每次5分钟
2. 阻止非特异性结合位点在新鲜孵育切片30分钟制备的含有0.1％w/v BSA的1x PBS溶液的封闭溶液
3. 取出封闭溶液，加入在封闭溶液中1:500稀释的50μl抗DIG-AP ， Fab片段。在室温下孵育1小时。
4. 取出含有抗DIG-AP ， Fab片段的封闭溶液，并用10x洗涤缓冲液洗2次15分钟。
5. 使用吸管放置一滴含有洗涤缓冲液在微量载玻片上切片并用50稀释洗涤缓冲液 μlNBT/BCIP溶液（在洗涤缓冲液中1:50）。保持幻灯片黑暗（例如使用化学瓶盖作为盖子） NBT/BCIP是光敏感的！
6. 经常观察进展的显微镜下的染色反应，出现通常在2-3分钟内保持曝光短可能）。
7. 如果紫色染色清晰可见，停止与ddH 2 O 2反应并拍摄你的部分。图2显示了a 用于两个β-1,4-半乳糖苷酶的原位 RT-PCR分析的实例内切葡聚糖酶，AtCel1 和 KOR3 ，其是特异性上调的
  在拟南芥根中诱导的拟南芥合胞体。
  
  图2. 对合胞体诱导的部分的 AtCel2 和 KOR3 的原位 RT-PCR分析（a）在AtCel2 （b）（a）无聚合酶。未检测到污点。（c）控制在合胞体上方的根部上的（a）的反应。未检测到 AtCel2 的誊本。（d）强染色在合胞体中可以看到 KOR3 的转录物。（e）控制反应（d）不用聚合酶进行;没有可见的染色。（f）控制（d）在合胞体上方根部的反应。没有成绩单的 KOR3 可见。（a），（b），（d）和（e）比例尺=50μm; （c）和（f）比例尺=20μm。来自Wieczorek等人（2008），经许可。

笔记

RNA容易被RNA酶降解，并且应当使用几个不同的进食位点/根以增强该方法的成功率。然而，如果使用的饲养部位/根组织包含完整的RNA，则该方案的可重复性高且可变性低。
用阳性反应开始检测，随后对于对照使用完全相同的曝光时间
基因转录物特异性染色的着色可以从浅紫色到深紫色（几乎黑色）不同。对照切片（无Taq聚合酶）中的非特异性染色可以从浅棕色，微红至非常微弱/几乎透明。

食谱

固定溶液
63％乙醇
PBS中的5％甲醛（含有DEPC-ddH 2 O，pH7.2）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
10mM Na 2 HPO 4
130mM NaCl，在DEPC-ddH 2 O中 pH 7.5
20x SSC
3 M NaCl
300mM C 6 H 5 O 7，H 2 O 7，H 2 O 3，H 2 O 3，。在DEPC-ddH 2 O 2中的3Na（柠檬酸钠二水合物）
10x PCR缓冲液
160mM（NH 4）2 SO 4 4
670mM Tris-HCl（pH8.8）（在25℃） 15mM MgCl 2·h/v 0.1％Tween 20
10×洗涤缓冲液
0.1M Tris-HCl
0.15 M NaCl
pH 9.5

致谢

该方案是由Koltai和Bird（2000）和Urbanczyk-Wlochniak等人（2002）先前公布的方法的组合，并且已经被另外修饰。这项工作得到了来自欧盟在第五框架内的授权QLK-CT-1999-01501（'NONEMA'）和FWF授予P16296-B06，P16897-B06和P21067-B12的支持。

参考文献

Hofmann，J.，Wieczorek，K.，Blochl，A.and Grundler，F.M。（2007）。线虫诱导的合胞体的蔗糖供应取决于胞质和symplasmic途径。 J Exp Bot 58（7）：1591-1601。
Koltai，H。和Bird，D.M。（2000）。通过液相现场实现特定植物mRNA的高通量细胞定位组织切片的逆转录聚合酶链反应。植物生理学123（4）：1203-1212。
Siddique，S.，Endres，S.，Atkins，JM，Szakasits，D.，Wieczorek，K.，Hofmann，J.，Blaukopf，C.，Urwin，PE，Tenhaken，R.，Grundler，FM，Kreil，DP和Bohlmann，H。（2009）。肌醇加氧酶基因参与由Heterodera schachtii诱导的合胞体的发育， 184
Urbanczyk-Wochniak，E.，Filipecki，M。和Przybecki，Z。（2002）。在植物组织上进行原位 RT-PCR的有用方案。/a> Cell Mol Biol Lett 7（1）：7-18。
Wieczorek，K.，Golecki，B.，Gerdes，L.，Heinen，P.，Szakasits，D.，Durachko，DM，Cosgrove，DJ，Kreil，DP，Puzio，PS，Bohlmann，H。和Grundler， 2006）。扩展蛋白参与拟南芥根中线虫诱导的合胞体的形成， Plant J 48（1）：98-112。
Wieczorek，K.，Hofmann，J.，Blochl，A.，Szakasits，D.，Bohlmann，H.and Grundler，F.M。（2008）。拟南芥内切-1,4-β-葡聚糖酶参与植物J 53（2）：336-351。