材料和试剂

含血红素的样品
注意：您的储备溶液中血红素的浓度应至少为10μM，而不要大于80μM。二硫苏糖醇（DTT）和其他还原剂可以还原铁氰化钾并且可以干扰氧化的样品，但不干扰还原的样品。任何生物缓冲液应当与该程序相容，只要其在500nm至600nm范围内没有显着的吸光度并且不与血红素形成复合物，如所有的好的缓冲区。我们亲自使用磷酸盐，tris，HEPES，EPPS，MES和CHES没有问题。
0.5 M NaOH
吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：360570）
铁氰化钾（III）（Sigma-Aldrich，目录号：702587）
连二亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：157953-5G）
去离子水
0.2M NaOH，40％（v/v）吡啶，500μM铁氰化钾（参见配方）
0.1M铁氰化钾（K 3 [Fe（CN）6]]）（参见配方）
在0.5M NaOH中的0.5M连二亚硫酸钠（参见配方）

设备

分光光度计带宽≤2 nm
通风橱
石英或玻璃比色皿，1厘米长
移液器
ote：通常，具有能够具有相对低的光谱带宽（SBW）的分光光度计以获得高精度的测量是好的。在文献中建议SBW与自然带宽（NBW）的比率应为0.1或更低，以便得到小于0.5％的误差（Surles和Erickson，1974; Brodersen，1954）。还原的吡啶血色素的α带具有约20nm的NBW，因此推荐SBW为2nm或更小。如果您不确定SBW，请与制造商联系。大多数现代分光光度计具有小于4nm的SBW，对应于小于2％的误差。同样重要的是注意这个误差不是随机的，而是导致真实吸光度的低估;具有较高的SBW/NBW比率导致吸收峰的"平坦化"。如果可能，使用扫描分光光度计。这允许您验证您的光谱看起来类似于图1所示的光谱。

图1.还原和氧化的吡啶血色素（血红素b）的示例光谱。带宽设置为1 nm，数据间隔为1 nm。

程序

如下所示的体积可以根据需要按比例放大或缩小，只要浓度保持不变即可。

将分光光度计设置为≤2 nm SBW（如果可调节）和500 nm至600 nm之间的1 nm数据间隔（至少）。该测定不是强烈温度敏感; 室温工作良好。
将溶液I与1：1混合的分光光度计与您的蛋白质样品所在的缓冲液混合。
空的比色杯。向0.5ml含血红素的样品中加入0.5ml溶液I，混匀。
扫描此混合物;这是您的氧化样本。
加入10μl溶液III到您的氧化样品，并混匀。样品应变为微红色。
每分钟立即再次扫描，直到吸光度峰不再增加;这应该不超过5分钟。具有最高峰的扫描是降低的光谱。
使用表1中的消光系数，并考虑到您的稀释因子，使用比尔定律计算原始样品中血红素的浓度，其中吸光度=消光系数 x 浓度 x 路径长度）。您可以使用缩减样品的绝对吸光度或差谱。

表1.吡啶血色素的消光系数化合物
波长
ε（mM ^-1 cm ^{-1 ）
溶剂
参考
Pyr ₂ -heme b 减少
557 nm
34.7
NaOH，10-40％pyr。
Paul 等人，1953年
Pyr <2> ，红色。 - 氧化。
557nm min 540nm
23.98
NaOH，10-40％pyr。
Berry和Trumpower，1987年
Pyr <2> ，红色。 - 氧化。
587nm min 620nm
23.98
NaOH，10-40％pyr。
Berry和Trumpower，1987年
Pyr ₂ -heme c 减少
550 nm
30.27
NaOH，10-40％pyr。
Berry和Trumpower，1987年
Pyr <2> ，红色。 - 氧化。
550nm min 535nm
23.97
NaOH，10-40％pyr。
Berry和Trumpower，1987年}
要确定血红素与天然蛋白结合时的消光系数，您还需要在合适的缓冲液中对蛋白样品进行高质量扫描。使用Beer定律和样品血红素浓度，计算您的天然蛋白的血红素吸收峰的ε

食谱

溶液I [0.2M NaOH，40％（v/v）吡啶，500μM铁氰化钾] 在通风橱或通风良好的空间中加入2/5体积的0.5M NaOH至2/5体积吡啶，用水稀释至最终体积
加入1/200体积的0.1M铁氰化钾（溶液II）
Paul等人（1953）报道，NaOH浓度在0.02至0.5M之间，吡啶浓度在10％至50％之间，与血色素的摩尔吸光度没有差异。
危害：吡啶是有毒的，易燃的，并且具有默克索引称为"特性不愉快的气味"。在通风橱或通风良好的区域混合溶液。
警告：吡啶最终氧化;当这种情况发生时，它变成黄色。不要使用黄色，使用后密封吡啶瓶。
溶液II {0.1M铁氰化钾（K 3 [Fe（CN）6]]）} / 危害：如果与强酸混合，释放氰化物。
警告：铁氰化钾必须新鲜并在24小时内使用。在单独的容器中处理。
溶液III（0.5M NaOH中的0.5M连二亚硫酸钠）无论供应商如何，连续测定的连二亚硫酸钠通常不超过85％纯度。（
注意：它应该总是溶解和稀释在中性或碱性溶液中;酸性条件使其释放硫化氢，有毒气体。它必须每次都新鲜。
储存：连二亚硫酸钠应远离水。新鲜的连二亚硫酸钠是粉状和自由流动的。最好是少量购买，并定期打开新鲜的瓶子，因为暴露于空气下降解（McKenna等人，1991）。连二亚硫酸钠在pH 7.0,25℃下具有-0.66V的氧化还原电位（Mayhew，1978），并且在> 400 nm区域。

致谢

这项工作的部分资金来自NIH（GM080563）授予F. G.和UCLA论文年奖学金给I. B.我们也要感谢亚伦·T·史密斯和朱迪思N.布斯特廷的建议。

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