材料和试剂

拟南芥
乙酸，冰川（Certified ACS），Fisher Chemical（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
甲醛溶液（Sigma-Aldrich目录，编号：47629）
乙醇（VWR International，目录号：83813360）
乙酸酐（Sigma-Aldrich，目录号：320102）
TWEEN 20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
（Fisher Scientific，目录号：AC2717500190），其中所述化合物具有以下结构：其中R 1，R 2，R 3，R 4，
具有硬化剂I和II（Heraeus Kulzer GmbH，目录号：64709003）的Technovit 7100
甲苯胺蓝（EMD Millipore Corporation，目录号：1159300025）
DPX安装介质（苯乙烯，增塑剂和二甲苯的混合物）（Sigma-Aldrich，目录号：M1289-10ML）
对象载玻片（superfrost plus adhesion slides）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10143352）
玻璃切片刀（SPI Easy-cut Ultra/Glass，目录号：07668-BA）
封面
微量离心管，PCR管或模具（电子显微镜科学，目录号：70900）
磷酸盐缓冲液（参见配方）
Technovit解决方案（参见配方）
具有硬化剂II的Technovit溶液（参见配方）

设备

真空泵（Welch USA-BRS，目录号：2522C-02）
真空瓶
镊子
加热板（Bekso，型号：TH3N）
旋转切片机（Leica Reichert-Jung，目录号：2040）
装配有数字照相机（ZEISS，型号：AxioCamCm1）的明视场显微镜（ZEISS，型号：Axio Scope A1）

程序

固定：在5％乙酸，5％甲醛和50％乙醇的溶液中在真空下解剖和固定整个拟南芥叶片1小时。或者，具有一滴Tween-20的乙醇：乙酸酐（3:1）可用于固定。固定优选在玻璃小瓶中进行以允许叶的可视化，并且来自单个阶段/处理的多个重复叶可以在相同体积中处理。样品应该下沉，因为这指示固定剂的良好渗透。将叶子在4℃下在相同的固定溶液中存储过夜
冲洗：用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗固定叶样品
脱水：在一定体积的乙醇中通过连续孵育（注1）使组织脱水，足以浸没自由浮动的标本，而不会被容器的侧壁收缩：
- 30％乙醇，持续4小时
- 50％乙醇，持续4小时
- 70％乙醇4小时，过夜或样品可以在4°C下存储最多2周
- 80％乙醇4小时
- 90％乙醇4小时
- 95％乙醇4小时或在4℃过夜
- 98％乙醇1小时
- 99％乙醇1小时
- 100％乙醇1小时。重复此步骤一次。
预浸渍：要用Technovit 7100树脂（图1a）替换乙醇，请执行以下步骤（注2）：
- 30％Technovit溶液和70％乙醇（由100％乙醇组成）15小时 - 50％Technovit溶液和50％乙醇（由100％乙醇组成）15小时 -70％Technovit溶液和30％乙醇（由100％乙醇组成）15小时
渗透：用100％Technovit溶液替换上述溶液，并在室温下孵育15小时。
聚合：将叶片样品置于模具（图1b-f）或微量离心管（图1g-h）中，并加入具有硬化剂II的Technovit溶液。让它在37℃下在封闭的环境中聚合过夜，即，覆盖模具或盖微量离心管以避免蒸发（注3）。样品可以水平嵌入模具中，如图1e所示，或者平面模具可以在2个投影投影透明片（Beeckman和Viane，1999）之间制成，然后将其垂直嵌入微量离心管中。

图1.协议的后续步骤。工作空间概述;公元前。制备和添加具有硬化剂II的Technovit溶液至模具; d-e。将样品放置在期望的取向; F。聚合树脂块含有样品（箭头）; g-h。或者PCR管可用作模具;一世。树脂块连接到切片机样品架上; j。放在加热板上的载玻片上的样品; k。横向，染色的叶片使用明视场显微镜可视化
将聚合的样品水平放置（图1i）在切片机中以获得横切片。使用旋转切片机上的玻璃刀切割所需厚度的切片（在这种情况下为2μm）
用镊子取出一个部分，放入一个水滴在物体幻灯片上。
将物体载玻片放在加热板上，温度为30-40°C，使其干燥（图1j）
染色：用0.05％（w/v）甲苯胺蓝溶液将载物片上的切片染色10分钟，并用蒸馏水冲洗1分钟。
在加热板上在30-40℃下干燥物体载片上的部分，并使用DEPEX作为固定剂安装盖玻片。
使用配有数码相机的明场显微镜以20倍或40倍放大倍数拍摄切片的照片（图1k）。

笔记

所有连续的孵育步骤应该在不改变容器和移除培养步骤之间的溶液通过移液器进行，以避免组织损伤。
样品可以在包埋之前用中性红或甲苯胺蓝预染色，以帮助可视化，达到所需的取向
Technovit树脂嵌入与广泛的染色，包括免疫定位，酶组织化学，原位杂交和一系列经典的组织学染色（Willbold和Witte，2010）兼容。

食谱

磷酸盐缓冲液
在1L水中加入13.799g NaH 2 PO 4 subO 2 .H 2 H 2 O在
将pH调节至7.2
Technovit溶剂
在100毫升Technovit 7100中加入1克硬化剂I，避免光线照射
它可以在4℃保存几个星期
具有硬化剂II的Technovit溶液
在15ml Technovit溶液中加入1ml硬化剂II，搅拌混合并保持在冰上避免聚合
制作新鲜溶液并立即使用

致谢

我们要感谢Maria Njo的技术支持。这项工作得到了安特卫普大学研究委员会和比利时联邦大学吸引力项目（IAP7/29，MARS）的一项协调研究活动（GOA）研究资助，"A Systems Biology Approach of Leaf Morphogenesis" 科学政策办公室（BELSPO）。 Shweta Kalve由佛兰芒政府科学和教育部的培训资助。作者承认研究基金会佛兰德斯（FWO-Vlaanderen）的财政支持。

参考文献

Beeckman，T。和Viane，R。（2000）。嵌入薄植物样本用于定向切片。生物技术Histochem 75（1）：23-26
De Smet，I.，Chaerle，P.，Vanneste，S.，De Rycke，R.，Inze，D.and Beeckman，T。（2004）。横断面的简单而多用的嵌入方法 J Microsc < em> 213（Pt 1）：76-80
Kalve，S.，Fotschki，J.，Beeckman，T.，Vissenberg，K.and Beemster，G.T。（2014）。拟南芥的整个发育过程中细胞分裂和扩增的三维模式叶。 65（22）：6385-6397。
Willbold，E。和Witte，F。（2010）。使用Technovit 9100新嵌入技术在硬组织 - 种植体界面上进行组织学和研究。 6（11）：4447-4455