材料和试剂

细菌培养物[铜绿假单胞菌 PA14]。对于大肠杆菌（BW25113）和金黄色葡萄球菌（ATCC，目录号：6538）也已进行了该方法。
LB肉汤Lennox（BD，目录号：240230）
盐酸环丙沙星（Corning Incorporated，目录号：61-277-RF）
琼脂（BD，目录号：214040）
（VWR International，BDH ，目录号：0288-VBD）
去离子水（蒸馏水）
氯化钠（VWR International，BDH ，目录号：0241-VBD）
缠绕的Masterflex过氧化物固化的硅氧烷管，L/S 14,250英尺（Cole-Parmer，目录号：UX-96407-14）
Masterflex Norprene管（A60G），L/S 13,50英尺（Cole-Parmer，目录号：UX-06404-13）
PVDF有倒钩的Y型连接器，3/8"ID，1/4"，2-3/8"，1-3/4" Pack Of 10（Cole-Parmer，目录号：WU-30703-93）
直型连接器，清除PP，1/16"ID，1/32"，25/32"，1/4"（Cole-Parmer，目录号：WU-30506-00）
倒钩连接器，清除PP，1/8"x 1/16"ID，3/32"，13/16"，1/8"（Cole-Parmer，目录号：WU-30506-06）
倒钩接头，T型连接器，Kynar，1/4"ID，1/8"，1-15/16"，1-5/16" 10/pack（Cole-Parmer，目录号：WU-30703-75）
无菌培养皿
Microfuge管
注射器60 ml
注射器针（量规21G）
微量移液器（P1000，P200，P20）
铝箔
盐水（见配方）
盐水与Mg 2+ sub 4+ ^。 7H O（参见配方）
LB琼脂，其中Mg 2 Cl 4 sub 7H O（参见配方）

设备

蠕动泵（Cole-Parmer，目录号：EW-07553-80），带有8通道，6个辊，3挡Ismatec小型泵头（Cole-Parmer，目录号：EW-78002-50）
接口（VWR ^®套筒塞）（VWR International，目录号：89097-534）
GeneMate Incubated Shakers（BioExpress，目录号：H-2000-M）
通用实验室培养箱，SHEL LAB（BioExpress，目录号：G-1400-1）
Nalgene ^® Carboys with Handles，Polypropylene，Thermo Scientific（VWR International，目录号：16101-084）
Nalgene ^® Top Works ^TM无菌封闭系统，硅胶，用于瓶和瓶，Thermo Scientific（VWR国际，目录号：2135-8303）
Acro ^® 50通风过滤器，Pall Laboratory（VWR国际，目录号：28143-616）
锥形烧瓶（150ml）
均质器（PRO SCIENTIFIC，型号：Bio-Gen Pro200）
台式冷冻离心机（Eppendorf，目录号：5418R）
分光光度计（BD，目录号：DU700系列）

程序

持续细胞分离的程序依赖于通过使用环丙沙星作为选择的抗生素的SOS反应的激活以及严格反应（Keren等人，2004; Sufya et al。，2003; Dör等人，2009）和盐水作为载体溶液（Sufya等人，2003）。环丙沙星的存在通过涉及recA 和 lexA 的机制激活SOS DNA损伤反应，并且所有非持续细胞被杀死，而同时，持续细胞当表达特定的高或低水平的SOS功能时形成发生（Dör等人，2009）。使用盐水作为环丙沙星的载体导致营养物质的缺乏并激活严格的反应，其中relA 和 spoT 的激活导致抑制rRNA合成的ppGpp水平增加并导致细胞代谢的减少和更多数量的持续细胞（Bernier等人，2013，Potrykus和Cashel，2008）。在从浮游生物或生物膜细胞群中分离持续细胞后，必须通过执行部分C来确认持续细胞状态。

将浮游细胞与浮游性固定期细胞隔离
1. 在细菌的冷冻原液的LB琼脂上制备条板感兴趣，并在静态条件下在37℃孵育24小时
2. 从条纹板上除去1-2个菌落，并接种5ml LB肉汤的肉汤培养物
3. 在37℃下搅拌（220rpm）孵育12小时（过夜培养）
4. 在50ml的新鲜LB培养基中稀释过夜培养物至1％锥形瓶。注2描述了可能出现的问题接种变异性
5. 在37℃下搅拌（220rpm）孵育24小时
6. 通过在4℃下以16,000×g离心5分钟收集细胞
7. 重悬于50ml冷（冷藏并保持在冰上）盐水（0.85％NaCl）
8. 重复步骤A6-7。
9. 在600nm波长（OD 600）测量细胞浊度。
10. 计算需要多少培养物（现在在盐水中）在25ml中具有0.8的最终OD <600> 。
  1. 示例：初始OD <600> 为2.0
  2. 最终OD <600>需要的是0.8 /
  3. 所需的最终体积为25ml
  4. 所以，所需的文化体积是
11. 一式两份，取出10毫升（按实例）的培养物到新鲜的离心管中
12. 通过在4℃下以16,000×g离心5分钟收集细胞
13. 重悬于25 ml冷（冷藏）盐水中。
14. 以20倍的最小抑制浓度（MIC）加入环丙沙星（处理的样品）或含有乙酸的盐水浓度，以解释存在于中的乙酸环丙沙星储备溶液（对照）。对于 p。铜绿 PA14，我们使用浓度为20μg/ml的环丙沙星（原始储备溶液环丙沙星在含0.1％乙酸的盐水中为4mg/ml）。
  注意：使用Andrews（2001）描述的方法计算MIC。不同的菌株和相同的菌株在另一个实验室可以具有不同的MIC，因此需要对每个MIC进行计算个别细菌菌株。
15. 在37℃下搅拌（220rpm）孵育24小时
16. 在时间点0，1，3，5，7，9，12，15和24小时进行取样（500μl）。
17. 对于每个时间点，执行从0到10 ^-6的一组10 - 系列稀释系列。
18. 将每个样品稀释液倒入LB琼脂平板（100× 15mm），其含有1％MgCl 2·7H 2 O·7H 2 O（以中和环丙沙星），并允许使液滴在琼脂表面滑动，形成一条线，使液滴传播和殖民地具有更高的生长表面积。每块板可以有最多5滴。进行三次重复的样品板以确保精度。
19. 在37℃孵育平板24-48小时。
20. 计数菌落在10-100之间。
21. 计算CFU/ml：
  1. 10 10稀释液中的实施例＃集落（50），CFU/ml将是：50×10 2 /0.01=5×10 5/sup> CFU/ml。
22. 绘制结果为活细胞％对时间。活细胞％基于为时间0获得的CFU/ml计算，其被考虑作为100％活细胞
23. 进行四次实验，这将允许计算所获得的结果是否当使用时比较对照和处理的样品时统计学显着 ANOVA，随后进行Tukey比较检验。
持续细胞与生物膜隔离
如下文参考文献（Sauer等人，2002; Davies和Marques，2009; Marques等人，2014）中所述在管式反应器上培养生物膜，并简要地在注1中
1. 重复上述步骤中的步骤A1-5，用于使浮游细胞与浮游培养物分离。
2. 测量过夜培养物的OD 600，并在50ml LB培养基中使培养物标准化以具有0.8的OD 600.
3. 用60毫升注射器用针吸出培养物，然后盖针。在无菌条件下执行所有这些操作。
4. 用2ml培养物接种每个管反应器（图2）
5. 在室温下孵育1小时 - 以允许细菌以连接到硅胶管（这个时间可以变化，取决于细菌菌株） - 启动流动。
6. 允许生物膜发展6天的时间。
7. 将生物膜暴露于盐水或150μg/ml环丙沙星（150x MIC）在盐水中，持续24小时。在0，1，3，5，7，9， 12和24小时。
8. 在每个时间点，对于每个样品（一个对照和一个处理），需要牺牲一个生物膜管和其内容物需要使用滚针法收获（Sauer等人，，2002; Davies和Marques，2009; Marques等人，2014）。硅胶包含生物膜的管（图2）从接种端口并从废物中放置到实验台上，之后其中，销在管的顶部上滚动以挤出液体并将生物膜糊剂倒入含有1ml盐水的离心管中与1％MgCl 2 2·7H 2 O（以中和环丙沙星）。
9. 均质化样品使用匀浆器以速度4（约20,000rpm）进行期间20秒。用70％乙醇在样品之间消毒匀浆器持续1分钟，然后加入无菌水。将样品保存在冰上在此步骤中。
10. 执行从0到10-8的一组10 - 系列稀释系列。
11. 将10μl样品滴在含有1％ MgCl 2 2 7H 2 O。每个板最多可以有5滴。至少执行复制板以确保准确性
12. 在37℃孵育平板24-48小时。
13. 计数菌落在10-100之间。
14. 计算CFU/cm ²：
  1. 10 10稀释液中的实施例＃集落（50），CFU/ml将是：50×10 2 /0.01=5×10 5/sup> CFU/ml
  2. 如果将样品收集到1ml中，则总CFU为5×10 5 CFU。
  3. 如果管的内部体积为2cm 2，那么CFU/cm 2 将为：5×10 5/s/2 = 2.5× 10 CFU/cm 2 。
15. 将结果绘制为活细胞的％对时间。活细胞％基于为时间0获得的CFU/ml计算，其被考虑作为100％活细胞
16. 进行四次实验，这将允许计算所获得的结果是否当将对照与处理的样品比较时，统计学显着使用ANOVA，然后进行Tukey比较检验。
确认持续细胞状态。
1. 如上所述在A和B中分离持续细胞。
2. 在环丙沙星暴露18小时：
  1. 在浮游留菌细胞分离实验（上述A部分）中，收集存在于锥形瓶中的所有细胞，用于每次处理（环丙沙星或盐水）通过在16,000×g离心5分钟，在4 并将每个原始样品重悬于12.5ml盐水和12.5ml中的环丙沙星（20mg/L）。参见注3 从样品中分离死细胞
  2. 在生物膜持续细胞分离实验（上面B部分）切换环丙沙星暴露到盐水或另外的环丙沙星。
3. 在0,1,3,5,7,9,12和24小时监测活力，并如上所述处理数据。

代表数据

使用该方法，使用SOS响应作为标准程序分离持续细胞（Keren等人，2004;Dör等人，2009; Moker等人， et al。，2010; Keren et al。，2004; Pan et al。，2012; Niepa et al。， 2012; Hong 等人，2012）。当在浮游生物或生物膜培养物中进行持久细胞分离时，在环丙沙星存在下应观察到典型的双相杀伤曲线（图1A）。其中在前3-6小时观察到细胞数的指数减少，随后是杀死平台，其中没有观察到细胞活力的进一步降低。存在于该平台中的细胞被认为是细菌培养物中的持续细胞亚群，并且可以是总群体的0.0001至0.1％。
一旦分离出持续细胞，通过将分离的细胞暴露于环丙沙星（20mg/L）或盐水另外24小时来确定持续细胞状态。如果细胞真正处于持续状态，则没有观察到细胞活力的降低（图1B）

图1.来自p的生物膜群体的持续细胞的分离。铜绿假单胞菌。 A.在暴露于P时观察到的双相曲线。铜绿假单胞菌生物膜与环丙沙星（正方形）以及对照，暴露于盐水的生物膜（空心圆圈）。 B.与对照（倒三角形）相比，持续细胞状态的确认，持续细胞暴露于环丙沙星（黑色三角形）不会导致细胞活力的降低。（版权^© 2014，美国微生物学会（Marques ，2014）。

笔记

在这项工作中，生物膜在管式反应器系统（图2）中培养，所述管式反应器系统由L/S 14 Masterflex过氧化物固化的有机硅管道组成，其中5％的LB以10.8ml/h的速率泵送通过（Sauer等，，2002; Davies 和Marques，2009; Marques等人，2014）。每个管反应器用2ml标准化的过夜培养物（OD 600为0.8）接种，并在静态条件下培养1小时以促进细胞附着。
当在浮游群体中进行持续细胞分离时，接种物需要在实验之间相同地处理或持续细胞的数量将改变，产生变异性。因此，对于低细菌细胞接种物，持续细胞群中可能存在集落不存在，这不是由于持续细胞的缺乏，而是由于低细胞数目和使用CFU测定的活细胞评估的检测水平。
当确认浮游细胞群体中的持续细胞状态时，细胞沉淀将由于存在死细胞而呈现梯度。死细胞将容易地重悬在液体上，并且当去除上清液时将被去除，而活细胞将保留在沉淀中。

A

B

图2.生物膜管反应器系统。这是一个通过连续培养系统，其中生物膜在硅胶管内发展。细菌培养物接种在接种口上，生物膜从泵的下游发育。 A.含有4根硅胶管的管式反应器系统示意图。 B.组装的管式反应器系统，其包含16个硅树脂管，其中培养物将串联运行

食谱

盐水
8.5克氯化钠
1升去离子水
具有MgCl 2盐水的盐水 7H 2 O 8.5克氯化钠
10g MgCl 2 7H O
1升去离子水
具有MgCl 2的LB琼脂。 O
20克LB肉汤Lennox
15克琼脂
10g MgCl 2 7H O
1升去离子水

致谢

持久性分离是对先前公布的方案的修改（Keren等人，2004; Sufya等人，2003）。这项工作得到了SUNY结构基金的支持。

参考文献

Andrews，J.M。（2001）。最小抑制浓度的测定 J Antimicrob Chemother 48 Suppl 1：5-16。
Bernier，S.P.，Lebeaux，D.，DeFrancesco，A.S.，Valomon，A.，Soubigou，G.，Coppee，J.Y.，Ghigo，J.M.and Beloin，C。（2013）。饥饿，连同SOS反应，介导对氟喹诺酮氧氟沙星的高生物膜特异性耐受。 a> PLoS Genet 9（1）：e1003144。
Davies，D.G.and Marques，C.N。（2009）。脂肪酸信使负责诱导微生物生物膜中的分散。 J Bacteriol 191（5）：1393-1403
Dör，T.，Lewis，K。和Vulic，M。（2009）。 SOS响应在大肠杆菌中诱导氟喹诺酮持续存在。 PLoS Genet 5（12）：e1000760。
Hong，S.H.，Wang，X.，O'Connor，H.F.，Benedik，M.J.and Wood，T.K。（2012）。细菌持续性随着环境适应性降低而增加。 Microb Biotechnol 5（4）：509-522。
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Keren，I.，Shah，D.，Spoering，A.，Kaldalu，N.and Lewis，K。（2004）。专门的持续性细胞和大肠杆菌中的多药耐药机制。 J Bacteriol 186（24）：8172-8180。
Marques，C.N.，Morozov，A.，Planzos，P.and Zelaya，H.M。（2014）。脂肪酸信号分子顺式-2-癸烯酸增加代谢活性并将持续细胞恢复到抗微生物敏感状态。 Appl Environ Microbiol 80（22）：6976-6991。
Niepa，T.H.，Gilbert，J.L.and Ren，D。（2012）。通过弱电化学电流和妥布霉素的协同效应控制铜绿假单胞菌持续细胞。 Biomaterials 33（30）：7356-7365。
Pan，J.，Bahar，A.A。，Syed，H。和Ren，D。（2012）。绿脓杆菌PAO1持续细胞的抗生素耐受性由（Z）-4-溴-5-（溴甲基）-3-甲基呋喃-2（5H） - 酮。 PLoS One 7（9）：e45778。
Potrykus，K.和Cashel，M。（2008）。（p）ppGpp：仍然不可思议？ Annu Rev Microbiol 62：35-51。
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Sauer，K.，Cullen，M.C.，Rickard，A.H.，Zeef，L.A.，Davies，D.G。和Gilbert，P。（2004）。在绿脓假单胞菌中的营养诱导分散的表征 PAO1生物膜。 a> J Bacteriol 186（21）：7312-7326。
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