材料和试剂

线虫
注意：Caenorhabditis遗传学中心（CGC）是许多常用线虫的重要资源（ http://cbs.umn.edu/cgc/home ），但并非所有线虫都可通过此资源使用。例如，昆虫病原线虫（EPN）不能通过CGC获得，并且需要从现场取样收集或从另一个研究者的实验室请求。
要测试的所选气体百分比（例如 10％CO <2>）的天然气混合物，其余部分为N 2 2（Praxair，目录号：7727-37-9）
Parafilm（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-374-10）
石蜡油
Nalgene（Thermo Fisher Scientific，目录号：8000-0020）FTP 1/8"I.D。管道
苏打石灰（2-5mm粒料）（Sigma-Aldrich，目录号：72073）
½英寸特氟隆胶带
激光打印机透明胶片（如 Apollo VCG7060E）
低压系统配件套件（Bio-Rad Laboratories，目录号：7318220）
叠氮化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP9221-500）
BBL-琼脂（BD）或Difco-琼脂
100×15mm培养皿（VWR International，目录号：25384-088）
60×15mm培养皿（VWR International，目录号：25384-090）
1.55mm Whatman 1滤纸（Fisher Scientific，目录号：09-805B）
Blunt Luer-Lok针（例如HAMPTON RESEARCH CORP 22s/2"/3）
一次性10ml 10ml Luer-Lok注射器（例如BD）
一次性针（21号，1.5英寸）（例如BD）
1/8英寸I.D. （内径）PVC管
50ml气密注射器（例如HAMPTON RESEARCH CORP，型号：1050）
10ml气密注射器（例如HAMPTON RESEARCH CORP，型号：1010）
趋化性琼脂（参见Recipes）

设备

解剖立体显微镜（例如，徕卡显微系统公司，型号：Leica M80）
输注注射泵（例如哈佛装置，型号：PHD 22/2000）
31号钻头（3.05毫米）（如 Alltrade Tools LLC，型号：480902旋转工具组）
56号钻头（1.18毫米）（如 Alltrade Tools LLC，型号：480902旋转工具组）
Drill或dremmel（例如 Alltrade Tools LLC，型号：480902旋转工具套件）
防震平台（泡沫底有纸板平台）

程序

趋化性测定程序

准备趋化性测定
1. 在10厘米的培养皿盖上钻两个3.05毫米的孔，每个孔应该沿着直径从边缘1cm，正好彼此相对。为每个测定准备一个盖子，将同时进行，但是一旦准备好，盖子可以重复使用。
2. 连接柔性PVC管（1/8英寸内径）到每个孔的顶部，用管稍微突出到盖子的内部（图1A）。结尾进入板盖的PVC管可以用多层包裹 parafilm以确保紧密贴合。管道的另一端将是连接到50ml气密注射器（图1B）。底部的测定板应该具有附加的评分模板（图2）。
3. 刻痕模板可以印刷在透明胶片上并附着到使用小条双面胶带的测定板。评分区域是沿着板的每一侧上的2cm直径的圆直径，圆的中心距离板的边缘1cm。
4. 线虫可以通过首先加入1-2μl的20％TritonX-100来制备的水溶液加入到其中含有它们的瓶中。的线虫可以通过放置5个10μl的滴定量培养皿盖。可以计数存在的线虫的密度可以计算溶液中的线虫。足够的体积获得所需的线虫数量，然后可以放入 Eppendorf管，并允许休息2分钟或更长时间。线虫会沉到底部，并且可以吸出过量的水。颗粒然后可以通过移液管提取蠕虫。
气体趋化性测定
1. 在开始测定之前，立即填充50ml气密注射器根据实验。例如，如果评估吸引10％CO 2，一个注射器将填充10％CO 2，同时其他注射器将充满空气控制。注射器将使用注射泵（例如PHD）以0.5ml/min的速率降压 22/2000，Harvard Apparatus）。
2. 地点大约5-10微升含有约50-150个线虫的蠕虫小球测定板的中心。这些线虫应该是阶段匹配的或者尽可能同步。不同的生命阶段已知改变它们的气味偏好（Hallem等人，2011）。每个板应该不受干扰 - 在抗振平台上 - 持续时间测定。这些测定可以根据不同的长度运行进行特定实验。一小时似乎是标准，但是已经显示10,20,40和60分钟可以产生相同的结果在一些实验中（Hallem等人，2011）。
主机趋化性测定
1. 可以通过将多个宿主放置在50ml内来测试宿主顶空气密注射器; 该数量将根据主机大小而变化。
2. 主机顶部空间的吸引力也可以无需测试通过添加一列钠石灰到主体产生的CO 2的存在测定装置（图1C-D）。一个6英寸的Nalgene（8050-0250）柱 3/16"ID管可以填充2-5 mm钠石灰颗粒（图1C）。该柱的一端用可附接的配件731-8226安装到在另一端上运行到测定板盖的管道从低压连接到配件731-8223 配件套件。那一端应该紧贴在50的Luer-Lok末端 ml注射器（图1D）。配件可以用特氟隆胶带包裹确保气密配合。
3. 在测定结束时，数目应计数板的每一侧上的记分区域中的蠕虫趋化性指数应计算为：
  
  在该实施例中，测试的气味剂是CO 2，而室内空气是对照，但是相同的计算将用于其它气味剂，尽管控制可能不同。只有当≥3个蠕虫进入评分区域时，才应对分析进行评分，并且应当舍弃所有蠕虫表现出相同方向偏差的测定期的试验。
1. 所述测定意欲用作群体测定〜50-150线虫在实验中，但可以用于单线虫实验。
气味趋化性测定
1. 对于气味趋化性测定，将1μl的1M叠氮化钠放入中心作为麻醉剂。放置5微升的气味一个评分区域的中心，同时放置5μl的对照（石蜡油，dH 2 O或乙醇）在另一个的中心评分区。
2. 与气体测定，放置〜2微升的蠕虫在测定板的中心含有〜50-150个线虫的沉淀。离开测定板不受干扰，并在1小时后（对于宿主和CO 2趋化性测定）或3小时（用于气味测定）。一个可以在不使用叠氮化钠的情况下进行替代测定在分配的实验时间之后立即对测定板进行评分已经过去了。气味剂测定也可以在没有麻醉剂的情况下进行，但是然后在实验后立即需要对板进行评分完成。
  
  图1.趋化性测定设置。 A.图片10 cm测定板盖，其中具有两个3.05mm孔。每个孔距离1厘米沿着直径的边缘，恰好彼此相对。 1/8英寸 ID。 PVC管包裹在石蜡膜中，然后装入孔中。 B.A 1/8英寸管道的图片连接到气密注射器。 C.A 苏打石灰柱的图片，使用Nalgene（8050-0250） FTP 3/16"I.D.管道在两端有低压配件。在里面图片，该列为空，但在测定中将填充2-5 mm钠石灰颗粒。 D.附着的钠钙柱的图片到气密注射器和连接到测定的PVC管板盖
  
  图2.用于对趋化性测定进行评分的模板。线虫放置在起始位置测定和它们对化学气味剂的吸引力被评价为线虫在测定领域中分布。
趋化性测定的倾向性
1. 作为趋化性测定的延伸，可以是替代模板用于对趋化性指数和a的线虫评分趋化性指数（PCI）的倾向性。 PCI模板（图3）可以在透明纸上打印并连接到测定板上双面胶带。
2. 在评分期间发现的线虫数量在每个圆应该记录为正常。然后，每个区域应该并记录每个区域中的线虫数量。
3. 然后可以使用这些数据计算每个区域的总体百分比。
  
  图3.用于对两者的趋化性测定进行评分的模板趋化性指数（CI）和趋化性指数的倾向性。线虫是放置在测定开始的起始位置和它们对化学气味剂的吸引力被评价为线虫分布在测定领域。在这种情况下的评价由两者组成得分圈以及每个相应的区域：区域1，中间区域和区域2.
跳跃测定程序

准备跳跃测试
1. 在5cm培养皿和盖子的侧面钻一个1.25mm的孔允许在盖子上引入气味，从而防止干燥或草案的混杂效应（图4）。
2. 放置55 mm Whatman 1滤纸在底部的吸收和保留水分，同时提供纤维材料以促进跳跃。的滤纸充当土壤状底物。添加< 100线虫悬浮在〜200μl自来水中
3. 引入气体（例如 10％CO ₂）使用装备有Hamilton钝器的10ml Hamilton气密注射器针（22s/2"/3）（图4）。
4. 使用10ml Luer-Lok Becton Dickinson引入其他气味（例如昆虫顶空或气味剂）注射器用Becton Dickinson针（21规格1.5"）与末端削减钝。
主机诱发的跳跃测试
首次观察到属于Steinernema的线虫能够在Reed和Wallace（1965）中跳跃。这是在线虫中首次观察到的跳跃的实例，并且某些种类的斯坦内马马仍然是已知能够跳跃的唯一线虫。它显示，（平均身高的9倍），平均高度为3.9 + 0.1mm（身体长度的7倍）（Campbell和Kaya，1999）。跳跃是一个不寻常的行为，一个柔软，无肢，无脊椎动物
1. 对于主机诱发的跳跃，注射器内的主机数量根据宿主的大小而变化（Dillman等人，2012）。
2. 主机顶部空间的吸引力也可以无需测试存在主体产生的CO 2，通过在其间加入钠钙柱注射器和针。一个6英寸的Nalgene（8050-0250）柱 3/16"外径管可以填充2-5毫米的钠钙颗粒（图 1C）。该柱的一端用配件731-8226装配容纳针和在另一个与配件731-8223从a 低压配件工具包。配件可以用特氟隆胶带包裹确保气密配合。
气味诱发跳跃测定
1. 对于气味剂，将一小块滤纸放在注射器中将5μl未稀释的气味剂放在滤纸上。对照测定应使用与用于气味剂的稀释剂相同的稀释剂进行（例如石蜡油，水或乙醇）。盖上钻进的孔皿与石蜡膜和穿孔只在测定期间
2. 只要已知某些种类的Steinernema昆虫寄生线虫的感染性幼体（IJ）会跳跃（Campbell和Kaya，2000）。添加线虫到准备的跳跃竞技场在液体悬浮液中将约100条线虫悬浮于约200μl水中。均匀地将线虫悬浮液分布在滤纸上。这个测定可以通过放置单个线虫用于单线虫跳跃在竞技场中间的线虫通过吸取通过被拉扯的玻璃毛细管。用200μl自来水预先过滤滤纸。
3. 为了检查气味诱发跳跃，随机选择站立的个人线虫，并提出他们，一次一个，用小吹（〜0.5毫升体积）的空气控制或挥发性刺激。只有测试个人一次在站立开始。虽然它是可能的单个线虫跳不止一次，往往他们会坚持板的盖子跳后，这是不可能的研究者将测试已经跳过的线虫介绍通过慢慢地将注射器针尖在〜2mm内的气味站立的个体和递送混合物的小泡沫注射器（〜0.5ml体积）（图4）。
  观察并记录站立个体在8秒响应内的行为变化间隔后呈现提示。响应可以使用a 二元判断是否是个人跳跃还是可以如果需要，分成更多类别（Dillman等人，2012）
4. 一个然后可以计算归一化跳跃指数（J.I.）。对于刺激诱发的跳跃水平高于对照组。和SEM 应计算为：
  
  对于诱发比对照更低水平的跳跃的刺激，J.I。和SEM应计算为：
  
  以这种方式计算响应将导致归一化的J.I.范围从-1到+1。
1. 大约20 IJ可以从同一个舞台测试。和趋化性测定，钠钙柱可用于去除宿主产生的 CO 2。在跳跃测定中，2英寸Nalgene柱（8050-0250）FTP 3/16"OD管，包含2-5mm钠石灰颗粒。此列可以使用从低压配件套件的配件连接到注射器。接头731-8226可以连接到针头，而另一端柱用配件731-8223连接到注射器。那应该结束紧密贴合在50ml注射器的Luer-Lok末端（图1D）。的配件可以包裹在特氟龙胶带中，以确保气密配合。或者，柱可以放置在2个女性端的Swagelok之间适当尺寸的压缩配件（Dillman等人，2012）。
  
  图4.跳跃测定设置。A.跳跃测定图。 A 5 cm培养皿和盖子有一个1.25毫米的孔穿过侧面到允许在盖子上引入气味，从而防止干燥或草案的混杂效应。打开55 mm Whatman 1滤纸在底部吸收和保留水分，同时提供一个纤维材料以方便跳跃。引入气味剂慢慢地将注射器针尖放置在约2毫米的站立个体，同时递送少量的气味物质（〜0.5ml体积）。

代表数据

视频1.趋化性测定

视频2.跳跃测试

笔记

这些实验可以显示一些变化性，并且对温度，湿度的变化以及瞬时气味的引入（例如香水，古龙水，肥皂，食物，等等）是非常敏感的。我注意到，在附近烹饪或食用的食物，特别是香味食物，如爆米花，闻起来像引诱剂丁二酮，可以影响趋化性和跳跃行为。由于这些行为测定的高灵敏度和可变性，重要的是测试运行和对照使用相同的条件并行运行。有许多重复可以帮助增加行为信号。
虽然行为实验倾向于具有高灵敏度和变异性，但我发现使用这些技术的观察到的表型在许多天的实验和在不同批次的线虫之间，对于跳跃和趋化性是稳健的，尽管偶尔具有异常行为的批次。 br /> 趋化性测定的倾向是常规趋化性测定的有趣延伸，其提供更多数据和更好的分辨率到趋化性行为。虽然先前的工作显示了几种物种的高趋化性指数，这导致读者得出结论，物种具有相似的化学吸引偏好和能力（例如2011年; Hallem等人2011; Dillman& 2012），PCI测定可能揭示这些物种之间趋化性的倾向性的差异。例如， glaseri carpocapsae 可能都具有高CI对蜡虫气味，也许只有20％的。 carpocapsae 群体参与行为，而80％的 S。 glaseri 可能正在参与。 PCI是探索线虫嗅觉反应的行为生态学的另一种方式。

食谱

趋化性琼脂
1.6％BBL-琼脂或2％Difco-琼脂 5mM磷酸钾（pH6.0） 1mM CaCl 2
1mM MgSO 4

致谢

该实验室方案是对各种已公开和未公开的方案的自由适应，并且随着时间演变（Ward，1973; Bargmann等，1993; Campbell和Kaya，2000; Hallem等，，2011; Dillman等人，2012; Castelletto 等人，2014）。 A.R.D. 由来自加州大学河滨分校的初始实验室启动资金资助。

参考文献

Bargmann，C.I.，Hartwieg，E。和Horvitz，H.R。（1993）。气味选择性基因和神经元在C中介导嗅觉。 elegans 。 74（3）：515-527
Campbell，J.F。和Kaya，H.K。（1999）。寄生线虫的跳跃方式和原因。自然 397：485-486
Campbell，J.F。和Kaya，H.K。（2000）。昆虫相关线索对昆虫病原线虫跳跃行为的影响（Steinernema&/em> spp。）行为 137：591-609
Castelletto，M.L.，Gang，S.S.，Okubo，R.P.，Tselikova，A.A.，Nolan，T.J.，Platzer，E.G.，Lok，J.B.and Hallem，E.A。（2014）。皮肤穿透性线虫的不同宿主寻求行为。 /em> 10（8）：e1004305。
Dillman，A.R。和Sternberg，P.W。（2012）。昆虫致病性线虫。Curr Biol 22（11）： R430-431。
Dillman，A.R.，Guillermin，M.L.，Lee，J.H.，Kim，B.，Sternberg，P.W.and Hallem，E.A。（2012）。嗅觉在寄生线虫中形成寄主寄生虫相互作用。 Proc Natl Acad Sci USA 109（35）：E2324-2333。
Hallem，E.A.，Dillman，A.R.，Hong，A.V.，Zhang，Y.，Yano，J.M.，DeMarco，S.F.and Sternberg，P.W。（2011）。主机寻求的感觉代码寄生线虫。 Curr Biol 21（5）：377-383。
Reed，E.M。和Wallace，H.R。（1965）。通过昆虫寄生线虫跳跃运动。 Nature 206：210-211
Ward，S。（1973）。线虫Caenorhabditis elegans的趋化性：：引诱物的鉴定和分析通过使用突变体的反应。 Proc Natl Acad Sci USA 70（3）：817-821。