材料和试剂

集胞藻 PCC 6803菌株（野生型，从S.Shestakov，Moscow State University，Russia获得）
（Carl Roth，目录号：5239.1）。
柠檬酸（Carl Roth，目录号：X863.2）
NaNO 3（Carl Roth，目录号：A136.2）
MgSO 4·7H 2 O（Carl Roth，目录号：P027.1）。
Na 2 -EDTA（Carl Roth，目录号：8043.2）
（Carl Roth，目录号：6943.1）
（Carl Roth，目录号：T881.3）
（Carl Roth，目录号：T884.1）
（Carl Roth，目录号：0274.1）。
（Carl Roth，目录号：HN16.1），其中所述氧化还原反应包括以下步骤：（a） br />
（Carl Roth，目录号：P024.1）
（Carl Roth，目录号：P028.2）。
柠檬酸铁铵（III）（Carl Roth，目录号：P027.1）
（Merck KGaA，Calbiochem ，目录号：105099）
2 - [（2-羟基-1,1-双（羟甲基）乙基）氨基]乙磺酸（TES）（Carl Roth，目录号：9137.3）
Bacto琼脂（BD Bioscience，目录号：214010）
注射器（50ml体积）
无菌注射器过滤器（Sarstedt Filtropur S0.2μm，目录号：83.1826.001和0.45μm，目录号：83.1826）
无菌96孔微量滴定板（ VWR International，目录号：734-2328）
100x BG11介质（参见配方）
微量金属混合物（见配方）
BG-11培养基的库存解决方案（参见配方）
1x BG11（2x BG11）（参见配方）
BG11琼脂（见配方）
溶液（参见配方）
（参见配方）。
0.25 M Na 2 EDTA-EDTA（参见配方）

设备

具有100ml体积的宽颈锥形瓶（Carl Roth，目录号：C146.1）
光源（18W/840）（Philips，型号：MASTER TL-D Super 80）
实验室振动器（一维轨道运动）（Heidolph Instruments GmbH，目录号：036130180）
UV/Vis分光光度计（Shimadzu，型号：UV-2401PC）
多通道移液管（8通道移液管，0.5-10μl和10-100μl）（Starlab ErgoOne ，目录号：S7108-0510和S7108-1100）
具有方形形状（120×120×17mm）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：688102）的培养皿
具有可调盖子的透射光扫描器（即爱普生完美v700照片，一个好的相机可以替代）
层流罩（即 Heraeus HeraSafe HS）
LI-190R量子传感器

程序

每个涉及处理蓝细菌细胞培养物的实验步骤必须在层流罩下进行以防止污染！

从琼脂平板接种蓝细菌液体培养物 BG11培养基（Rippka等人，1979），并连续振荡温育（150rpm）在30℃，在50的白光的恒定照明下在琼脂板的位置测量的2-3μmol/μmol光子m sup -2 s sup-1 天（用LI-190R量子传感器测量）。
注意：即使一些突变体携带插入的抗生素抗性基因盒它们的基因组，用于斑点测定的培养物总是在培养基中生长缺乏抗生素以排除在选择性培养基上生长的影响。没有特定的体积或OD需要，但预培养应该没有达到晚稳定期，它们的OD <750> 应该是相似的。
将生长良好的预培养物在最终稀释至OD 750±0.2 体积的20ml BG11培养基，并在上述条件下进一步孵育直到它们达到对数相（约 OD <750> 0.6-0.7）。
注意：在没有颜料吸收的波长下测量光密度是很重要的。
将对数生长的培养物再次稀释至OD 750±0.2。用新鲜稀释的培养物，用a稀释系列多通道移液管在无菌微量滴定板中，范围从10μL至 10 ^-7（图1）。

图1.活力分析的稀释系列。行B至H用180μlBG11培养基预先填充。每次稀释步骤后，将细胞悬浮液与移液管充分混合，然后将其一部分转移到下一个孔中

从每个稀释步骤中，将5μl一式三份点样使用多通道移液器加入补充的方形BG11琼脂平板上与0.3％（w/v）Na 2 S 2 O 3 sub的混合物。< br /> 注意：琼脂的确切组成定制。如果实验者希望观察下的生存力混合条件下，BG11琼脂可以补充葡萄糖。还可以从介质中排除铁或氮储备溶液。然而，不要忘记向板添加Na 2 SubS 2 O 3子。这对于集落的适当生长是重要的（Thiel等人， 1989）。
使液体培养物的液滴干燥约15-20分钟（封闭板，在室温下在桌上最佳）。然后，将板在30℃恒温孵育用50μmol光子的白光照射^{-2 ^{s ^-1 约5天或直到最高处没有更多的菌落出现稀释步骤注意：防止运动的光线运动应变，板应放置在光源和侧面下方应避免仅从一侧照射。为了阻止滴落（在液滴不完全干燥的情况下），板与盖子面向上孵育第一天。后第一天，将板上下颠倒以避免蒸发的水滴在斑点。对于浅 - 暗相关表型的研究，恒定照明也可以改变为明暗周期。在我们的病例，我们调查昼夜节律钟相关基因的突变体因此选择了12:12小时光照：暗培育。在这种情况下，将稀释系列的起始OD 750调整为0.4而不是 0.2（第2步）。}}
通过扫描记录结果（图2）板或通过拍照。在最好的情况下，甚至可能计数几个点（你可能需要一个双目显微镜）。

图2.点测定。将细胞培养物的稀释系列一式三份点样到方形BG11琼脂平板上。将板孵育直到在最高稀释步骤中不再出现菌落。菌株已由Dörrich等人公开。（2014）。

使用该方法产生的进一步结果由Dörrich等人（2014）出版。

笔记

上述斑点测定法是高度可重复的。与诸如测量液体培养物的光密度的其它方法相反，其通常由于聚集体的形成而易于出现错误，因此我们总是获得可靠和可重复的结果。在我们的小组内，几个研究人员在两个不同的实验室进行了这种方法，我们没有检测到任何结果的变化。为了再现性，强烈推荐在板中使用Na 2 S 2 Sub 3 O 3（如Recipes中所述），并在同一时间后记录结果。琼脂板的组成和光条件可以定制以适应实验者的个体需要，并且可能需要优化不同的突变株。

食谱

100x BG11介质

CaCl 2 ^。 2H O	3.6 g/L
柠檬酸
H3BO3	2.86 g/L
MnCl 2 ^。 4H O	1.81 g/L
ZnSO 4 。 7H O	0.222 g/L
Na 2 MoO 4 sub 。 2H O	0.390g/L
Co（NO <3>）₂ ^。 6H <2> O	0.049克/升

在ddH 2 O 2中制备这些溶液，并使用注射器和无菌过滤器过滤灭菌
无菌等分试样可以在4℃下保存

BG-11培养基的库存解决方案

Na ₂ 3
20 mg/ml

柠檬酸铁铵（III）
6 mg/ml

K _{2 HPO ₄ ^。 3H ₂ O} 30 mg/ml

TES缓冲液（pH8.0用NaOH调节）
1 M

准备这些解决方案在ddH2O和灭菌使用注射器和无菌过滤器过滤
无菌等分试样可以在4℃下保存

1x BG11（2x BG11）

100 x BG11	10ml/L（20ml/L）
Na 2 CO 2 3储备溶液	1ml/L（2ml/L）
K _{2 HPO ₄ ^。 3H <2> O储备液}	1ml/L（2ml/L）
柠檬酸铁铵（III）储液	1ml/L（2ml/L）
痕量金属混合原液	1ml/L（2ml/L）
TES缓冲液（pH 8.0）储液	10ml/L（20ml/L）

将无菌溶液加入ddH 2 O中，并将体积调节至1L
如果你使用非无菌溶液和高压灭菌媒体后，会有少量盐沉淀。在使用介质之前，应该彻底混合。这是建议，当你想避免污染的文化，特别是对长期应变维持。

BG11琼脂
在ddH 2 O中制备1.5％细菌用的琼脂和高压灭菌器。
将熔化的1.5％细菌细菌（约80℃）与相同体积的无菌2x BG11培养基混合。
溶液
溶液 30％w/v Na 2 S sub 2 O 3 sub / 30g Na 2 2 S 2 O 3 sub
将ddH ₂ O加到100 ml
过滤灭菌（0.2μm）
储存在4°C
0.25M Na 2 -EDTA（pH 8） 9.306g Na 2 2 -EDTA
将ddH ₂ O加到100 ml
用NaOH调节pH至8.0（使用高浓度NaOH，Na 2 EDTA不会溶解，直到pH达到8.0）
在室温下储存

致谢

BG11培养基根据Rippka等人制备。（1979）。这项工作是由DFG授予A.W.Wi2014/5-1支持的。

参考文献

Dörrich，A.K.，Mitschke，J.，Siadat，O。和Wilde，A。（2014）。删除 Synechocystis sp。在微暗条件下，PCC 6803 kaiAB1C1基因簇引起受损的细胞生长。微生物学 160（Pt 11）：2538-2550。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M。和Stanier，R.Y。（1979）。通用作业，应变历史和纯文化属性> Cyanobacteria 。 J Gen Microbiol （111）：1-61。
Thiel，T.，Bramble，J。和Rogers，S。（1989）。在固体介质上生长蓝藻的最佳条件。 FEMS Microbiol Lett 52（1-2）：27-31。