材料和试剂

逆转录酶（HIV-1 RT或PFV RT）。从p（His）6标记的p66/p51 HIV-1HXB2 RT-prot质粒（Corona等人，2014a）表达和纯化的HIV-1 RT，由BirgittaM.Wöhrl提供的PFV RT UniversitätBayreuth，Lehrstuhl Biopolymere，Bayreuth，Germany（Corona等人，2014b）。
蒸馏水（DNase/RNase-free UltraPure TM）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：10977-015）}
5'-GAUCUGAGCCUGGGAGCU-FLUORESCEIN-3'（HPLC，干燥，QC：质量检查）（Metabion）
5'-DABCYL-AGCTCCCAGGCTCAGATC-3'（HPLC，干燥，QC：质量检查）（Metabion）
1M KCl溶液（Sigma-Aldrich，目录号：60142-100ML-F）
1M MgCl 2溶液（Sigma-Aldrich，目录号：63069-100ML）
将1M二硫苏糖醇（DTT）溶液（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：P2375）}
由Trizma base （Sigma-Aldrich，目录号93352）制备的1M Tris-HCl溶液（pH7.8）
由Trizma base （Sigma-Aldrich，目录号：93352）制备的1M Tris-HCl溶液（pH 8.1）
5 M NaCl溶液（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：AM9760G）
EDTA（0.5M，pH 8.0）UltraPure TM（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-020）}
二甲基亚砜（DMSO）≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：D5879-1L）
微量离心管，扩展容量，体积0.65ml，刻度，硅化聚丙烯（Sigma-Aldrich，目录号：T3406-250EA）
OPTIPLATE-96F/50B（PerkinElmer，目录号：6005270）
HIV-1 RT反应混合物（1.25x）（参见配方）
PFV RT反应混合物（1.25x）（参见配方）

设备

热循环仪
制冷台式微量离心机
超声波浴（Elma超声波浴Transonic T 310）
涡流搅拌器
用于微孔板（Bionics）的多功能振动器
配有用于荧光荧光团490/528nm（激发/发射波长）的过滤器的多标记计数板读数器Victor 3（PerkinElmer，型号：1420-051）

程序

制备作为底物的RNA/DNA杂交体
1. 重新悬浮每个RNA和DNA寡核苷酸的最终浓度 500μM，在100mM Tris-HCl（pH 8.1），0.5mM EDTA（pH 8.0）中。
2. 制备50μM终浓度的RNA和DNA寡核苷酸的退火溶液用50mM NaCl的DNase/RNase-free水，然后等分50μl在0.2 ml PCR管。小心涡旋，然后在下旋转 5000转/分，以使所有的液体放置在管的底部
3. 不要在溶液上覆盖矿物油。将管放置在热循环仪并设置程序以执行以下配置文件：
  加热至95℃并在95℃保持2分钟;
  在45分钟的时间内冷却至25℃;
  继续存储温度为4°C。
4. RNA/DNA杂交溶液（50μM）准备使用（参见Recipes）。该溶液可以储存在-20℃。
抑制剂稀释液的制备
1. 将化合物的粉末溶解在DMSO中，浓度为10mM，（例如：10"，50Hz），并且如果需要（例如：2'45℃）加热它，以确保所有化合物在溶液中
2. 从开始 10mM的DMSO溶液使化合物在Milli-Q中的系列稀释纯化水：从1mM稀释开始并制备三倍相对于最终稀释10倍的浓缩物浓度。例如：1mM - > 333.33μM->111.11μM稀释将导致100μM->33.33μM-> 11.11μM。请见注释。
RNase H测定
1. 计划没有RT酶的实验（空白），使用RT酶缺乏抑制剂（对照），并且在存在增加的情况下抑制剂（样品）的浓度。最好使用较宽的范围的浓度具有更好的抑制曲线。反应体积为100μl
2. 在一个OPTIPLATE-96 F/50B中，首先加水（空白为20μl，对照为10μl）。
3. 加入80μlRT反应混合物（1.25x）
4. 在样品中加入10μl确定浓度的抑制剂稀释液（见图2为例）
5. 最后向每个孔（对照和样品）中加入10μl酶（20ng HIV-1 RT）或（2nM PFV RT）。
6. 盖上盖子，37°C孵育反应1小时在用于微量培养板的Multi Thermo-Shaker中以200rpm
7. 通过向每个孔中加入50μlEDTA（0.5M，pH 8.0）停止反应
8. 在490/528nm（激发/发射波长）对Victor 3的反应进行定量。
9. 通过从所有中减去空白的值来细化结果并用样本报告样本中的所得值抑制剂作为对照的百分比。
10. 计算插入抑制剂的IC 50值作为浓度报告了产品信号减少50％控制。

代表数据

图2.来自三次独立实验（生物学重复）的结果显示为对照的百分比。误差棒代表标准偏差。

笔记

该方案已应用于HIV-1和PFV RT酶。然而，它可以与几乎任何具有RNA酶H活性的RT酶一起使用。
我们建议使抑制剂稀释在水中，因为DMSO 溶剂影响RNase H活性，因此其在样品中的浓度不应该克服1.01％。

食谱

反应混合物（1.25x）
对于HIV-1 RT：
62.5mM Tris-HCl（pH7.8）
7.25M MgCl 2
1.25 M DTT
100 mM KCl
0.3125μMRNA/DNA杂交体
PFV RT反应混合物（1.25x）
62.5mM Tris-HCl（pH8.1） 7.25mM MgCl 2
1.25 mM DTT
100 mM KCl
0.3125μMRNA/DNA杂交体

致谢

带有p（His）6标签的p66/p51 HIV-1HXB2 RT-prot质粒由Stuart Le Grice Laboratory（NCI Frederick）友情提供。泡沫病毒逆转录酶由Birgitta M.WollerUniversitätBayreuth，Lehrstuhl Biopolymere，Bayreuth，Germany提供。该方案由Parniak等人（2003）修改和改编。

参考文献

Corona，A.，Di Leva，FS，Thierry，S.，Pescatori，L.，Cuzzucoli Crucitti，G.，Subra，F.，Delelis，O.，Esposito，F.，Rigogliuso，G.，Costi，，Cosconati，S.，Novellino，E.，Di Santo，R。和Tramontano，E。（2014a）。 Diketo酸衍生物识别参与抑制HIV-1 RNA酶H功能的高度保守的残基。/a> Antimicrob Agents Chemother 58（10）：6101-6110。
Corona，A.，Schneider，A.，Schweimer，K.，Rösch，P.，Wöhrl，B.M.and Tramontano，E。（2014b）。人类免疫缺陷病毒1型核糖核酸酶H抑制剂抑制泡沫病毒逆转录酶。 em> Antimicrob Agents Chemother 58（7）：4086-4093。
Parniak，M.A.，Min，K.L.，Budihas，S.R.，Le Grice，S.F.and Beutler，J.A。（2003）。基于荧光的高通量筛选测定人类免疫缺陷病毒-1逆转录酶相关的抑制剂核糖核酸酶H活性。 Anal Biochem 322（1）：33-39。