材料和试剂

4弱的拟南芥叶和根
超纯水
液体N <2>
冰
平底微量培养板（Deltalab，目录号：900011.1）
4mm直径的玻璃珠（Glaswarenfabrik Karl Hecht）（VWR International，目录号：201-0278）
1.2ml深孔存储板（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0564）
用于封盖8根管的EVA帽带（Micronic，目录号：MP227B1）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：500-006）
NADH（Sigma-Aldrich，目录号：43420）
PVPP（Sigma-Aldrich，目录号：77627）
甘油（EMD Millipore Corporation，目录号：104092）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-9284）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
KOH（EMD Millipore Corporation，目录号：105029）
MnCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED255）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
δ-氨基己酸（Sigma-Aldrich，目录号：A2504）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
CaCl 2（Panreac Applichem，目录号：131232）
2-氧代戊二酸酯（Merck KGaA，目录号：5194）
（NH 4）2 SO 4（Panreac Applichem，目录号：131140）
提取缓冲液（参见配方）
反应缓冲液（参见配方）
Bradford解决方案（参见配方）

设备

TissueLyser（RETSCH，型号：MM400）
板式离心机（Sigma，型号：2-16K）
吸光度酶标仪（Biotek Powerwave X 384微孔板分光光度计）
TissueLyser Adaptor Set 2×96（QIAGEN，目录号：69984）

程序

材料收获和均质化
1. 在96深孔（1.2ml）板中，将2个玻璃珠（直径4mm）置于每个孔中。
2. 称重约20毫克的新鲜叶子或根，并将它们放在 96深孔板，半浸没在液氮中。存放密封 EVA帽带在-80°C，直到使用
3. 研磨冷冻组织两次用TissueLyser在27Hz频率下持续60秒。板被耦合到 TissueLyser带有TissueLyser适配器套装2 x 96.（确保密封的均质化）。
提取
1. 每孔加入约3-5mg PVPP（这大约相当于微量刮铲水平）。
2. 向每个孔中加入500μl冷提取缓冲液，并快速混合倒置板（避免解冻样品之前添加缓冲）。
3. 使用TissueLyser再次将样品均匀化两次，以27Hz频率持续60秒
4. 在板式离心机中在4,000rpm和4℃下将板离心30分钟。
5. 回收在新的96深孔板中的上清液（400μl），并保持在冰上的样品。
通过Bradford方法测定蛋白质含量
1. 在96孔分光光度计板中，每孔放置1μl提取物并加入超纯水至10μl。用1μl的空白提取缓冲区。
2. 对于校准曲线放置BSA标准品在0至6μgBSA /孔的范围内，使用1μg/μlBSA原液和完全体积可达10μl。
3. 在每孔中加入240μlBradford溶液，并在室温下在黑暗中孵育5分钟
4. 读取595 nm处的吸光度。
酶活性测量
1. 每孔放置20μl的上清液。
2. 加入280μl反应物缓冲。该步骤应该自反应开始后快速进行一旦添加了缓冲区。因此，如果测量96个样品的使用建议多通道移液器确保重现性
3. 立即监测NADH进化动力学在340 nm的分光光度计在30℃下10分钟（图1）。确保分光光度计已经在30°C，然后加入反应缓冲液到样品
  
  图1.显示GDH胺化活性NADH消耗的图表
4. 对于NADH校准曲线，将300μlNADH稀释液从0-0.2mM，并在340nm读数。（NADH稀释液必须准备好在测量校准曲线之前避免氧化的NADH）

数据分析

为了测定提取物中的蛋白质浓度，从中减去每个样品的吸光度为空白的吸光度提取缓冲液）并计算蛋白质浓度校准曲线。
用获得的最大速度（Vmax）计算酶活性从NADH氧化监测在340 nm（不要采取两个第一分钟的测量考虑并确保线性活动）。从每个中减去空白（用提取缓冲液制成）采用NADH标准曲线计算GDH活性。最后表达每分钟和每μg消耗的每μmolNADH的活性蛋白质（从Bradford测定获得）或每mg新鲜/干重。

笔记

这个协议可以很容易适应eppendorf管和分光光度计比色皿代替96孔板只是缩放卷。类似地，样品的均质化可以用a 砂浆和杵，而不是TissueLyser。
如果可能，我们建议做每一个96孔板步骤使用多通道移液器，以节省时间，从而获得可重复性。
此协议是拟南芥，但它可以用于每个物种。对于某些物种，可以考虑对蛋白质提取物进行脱盐。

食谱

注意：所有溶液都应在超纯水中制备。

提取缓冲区
甘油10％
BSA 0.05％
Triton X-100 0.1％
50mM HEPES（pH7.5，用KOH调节） 10mM MgCl 2/
1mM EDTA
1 mM EGTA
1mM PMSF
10 mM DTT
1mM的δ-氨基己酸
1μM亮抑蛋白酶
反应缓冲液（pH 8）
100mM Tricine（pH8，用KOH调节） 1mM CaCl 2
50mM（NH 4）2 SO 4 4
0.25mM NADH 13 mM 2-氧代戊二酸盐
Bradford解决方案
稀释Bio-Rad蛋白测定染料试剂用超纯水浓缩1：5 储存在4°C的黑暗瓶中

致谢

该协议改编自Sarasketa等人（2014）并基于Groat和Vance（1981）报道的方法。这项工作得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的巴斯克政府（IT526-10），UPV/EHU（EHUA14/14），人民计划（Marie Curie Actions）编号334019和MINECO（BIO2014-56271-R）。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254。
Fontaine，JX，Terce-Laforgue，T.，Armengaud，P.，Clement，G.，Renou，JP，Pelletier，S.，Catterou，M.，Azzopardi，M.，Gibon，Y.，Lea，PJ，Hirel ，B.和Dubois，F。（2012）。拟南芥的NADH依赖性谷氨酸脱氢酶突变体的表征证明了该酶在根碳中的关键作用和氮代谢。植物细胞 24（10）：4044-4065。
Groat，R.G。和Vance，C.P。（1981）。苜蓿中氨同化的根瘤酶（ Medicago sativa L.）：开发植物病原体和对应用氮源的反应。

67（6）：1198-1203。
Sarasketa，A.，Gonzalez-Moro，M.B.，Gonzalez-Murua，C.and Marino，D。（2014）。在大面板的拟南芥自然种质中探索铵耐受性。 J Exp Bot 65（20）：6023-6033。