材料和试剂

BAC克隆No.RPCIB753M0921Q（GenomeCUBE）
LB培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3522-250G）
大构建试剂盒（QIAGEN，目录号：12462）
SP6（EuroFins MGW Operon LLC A Eurofins Genomics Company，目录号：SP050-1）和T7（EuroFins MGW Operon LLC A Eurofins Genomics Company，目录号：SP401）引物
（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：45200-029）。
Cy3-dUTP（GE Healthcare Dharmacon，目录号：45-000-738）
BioPrime阵列CGH试剂盒（模块）（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：18095-012）（其包括2.5个随机引物溶液，10x dUTP核苷酸混合物，Exo-Klenow片段）
带有Ultracel-30膜的Amicon Ultra-0.5离心过滤器单元（Merck KGaA，目录号：UFC503096）
人Cot-1 DNA（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15279-011）
DAPI溶液（1μg/ml）（Abbott Laboratories，目录号：06J49-001）
光谱绿色标记的Chr6着丝粒探针（CEP6）和杂交缓冲液（Abbott Laboratories，目录号：06J37-016和07J36-001）
微米离心过滤器（Merck KGaA，目录号：MRCF0R030）
TE缓冲液，1x Solution 500ml（USB，目录号：75893）
20x SSC（Abbott Laboratories，目录号：02J10-032）
0.3％NP40（Abbott Laboratories，目录号：07J05-001）
预处理试剂VP 2000（Abbott Laboratories，目录号：02J06-030）
蛋白酶1（250mg）（Abbott Laboratories，目录号：02J08-032）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：02860）
橡胶胶泥（Carfa AG，目录号：00494）
蛋白酶1（250mg在500ml蛋白酶缓冲液中）（Sauter等人，1995）
洗涤缓冲液（0.4SSC + 0.3％NP40-pH7-7.5）（Sauter等人，1995）

设备

载玻片保温箱（Memmert GmbH + Co.KG，模式：IPP 300）
移液管（Eppendorf）
Nanodrop分光光度计测定（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop 2000）
Slide（Thermo Fisher Scientific，目录号：10143352）
盖玻片（Biosystem 24×50mm，目录号：14071135638和R. Langenbrinck 21×26mm，目录号：01-2126）
用于变性的热板（Medax GmbH& Co.KG，目录号：12895）
Zeiss荧光显微镜，使用63x物镜（Carl Zeiss AG，型号：Axioskop 40）
AxioVision软件（Carl Zeiss AG，型号：SE64 Rel.4.9）

程序

如何使探头

用BAC克隆（例如甘油原液）接种起子培养物 2-5 ml LB培养基，含有合适的选择性抗生素（氯霉素）。
孵育过夜25/30°C，以200 rpm摇动
在500ml选择性LB培养基中稀释0.5ml起始培养物（1/500至1/1,000），含有合适的抗生素（氯霉素）。
孵育过夜，摇动（200 rpm）。
根据制造商的说明，使用大构建试剂盒分离BAC-DNA
通过使用1μg分离的DNA和20pmol SP6，T7引物分别测序来验证BAC身份
根据制造商的说明书用IluI限制酶消化〜1μgBAC-DNA。
将消化的BAC-DNA在无菌水中悬浮至终体积为21μl（BioPrime array CGH试剂盒）。
向每个样品中加入20μl的2.5x随机引物溶液（BioPrime array CGH试剂盒），并在95℃下孵育5分钟。
在冰上，加入5μl10x dUTP核苷酸混合物（BioPrime array CGH试剂盒）
加入3μlCy3-dUTP
加入1μl的Exo-Klenow片段（BioPrime array CGH试剂盒）
轻轻混匀，快速离心（5秒），37°C孵育2小时

每管加入5μl终止缓冲液并置于冰上（BioPrime array CGH试剂盒）

标签组合
试剂每个样品添加	每个样品添加的量
2.5x随机引物溶液（BioPrime array CGH试剂盒），并在95℃下孵育5分钟	20微升
在冰上，10x dUTP核苷酸混合物	5微升
Cy3-dUTP	3微升
Exo-Klenow片段	1微升
轻轻混合，快速离心（5秒），然后在37℃孵育2小时。
停止缓冲液到每个管，并放置在冰上（长期储存在-20℃）	5微升

用样品在盖子和侧面标记Micron管标识符，因为盖子倾向于破裂。也标签的一面过滤器标识符。
将Micron过滤器装入1.5 ml试管提供的试管，使过滤器在筛上在管内的脊
吸取450微升TE 1x到每个过滤器
将样品装入过滤器。
在室温下以8000xg离心10分钟。
检查过滤器（目视检查），以确保Cy3-Dye标记的DNA粘附在其上
向过滤器中加入500μlTE，并以8,000×g离心10分钟。
弃去流过，并置于新的1.5 ml过滤管中倒置以洗脱
以8000xg离心1分钟。
检查过滤器，以确保整个样品从中洗脱过滤器（在4°C短期储存样品，长期储存在-20°C）
加入20μlHuman Cot-1 DNA
加入5μlCEP 6.
加入35微升的杂交缓冲液（保存在冰上或-20°C存储）

如何准备组织
1. 预处理FFPE组织微阵列或FFPE全组织切片（7μm 厚）在90％EtOH-1分钟的100％EtOH-1分钟的二甲苯-1分钟内10分钟在70％EtOH-1分钟的H 2 O中
2. 继续在预热的石蜡预处理试剂VP2000（80℃）中预处理组织切片15分钟。
3. 将组织切片在H 2 O中浸泡1分钟
4. 将组织切片浸入预热的37°C 2小时蛋白酶缓冲液（蛋白酶1-250mg，在500ml蛋白酶缓冲液中）
5. 将组织切片在H 2 O中浸泡1分钟
6. 将组织切片在H 2 O中的100％EtOH-1分钟的90％EtoH-1分钟中浸泡在70％EtOH-1分钟中1分钟。
7. 让组织切片在室温下空气干燥约10分钟。
杂交
1. 在组织切片上涂抹10-20μl的探针并盖住
2. 使用橡胶水泥防止探针泄漏。
3. 将组织切片在75℃保持20分钟。
4. 在37℃下孵育过夜的组织切片。
5. 揭开组织切片。
6. 在室温下洗涤洗涤缓冲液中的组织切片5分钟
7. 洗涤组织切片在洗涤缓冲液，预热在48°C 在2-5分钟之间（当你有背景洗涤更长和更高温度）。
8. 在H 2 O中浸泡组织切片1分钟。
9. 让组织切片干燥保护它不受光。
10. 向组织切片中加入10-20μlDAPI溶液（1,000ng/ml）
11. 用24 x 50 mm的玻璃罩覆盖组织切片。
12. 将组织切片在4℃下放置15分钟。
13. 使用荧光显微镜（63x物镜）评估组织切片。
14. 在组织切片的四个独立区域独立计数最少100个肿瘤细胞核信号。

代表数据

FISH结果（代表性图片显示于图1中）根据以下进行解释：（1）绝对Chr6拷贝数和（2）比率VEGFA基因/Chr6拷贝数。我们分类为具有<1.8的VEGFA/Chr6比率和平均VEGFA拷贝数<4.0个信号/细胞的扩增样品;其中VEGFA/Chr6比率<2.0且每个细胞的平均VEGFA拷贝数≥4.0且<6.0个信号，并且以<2.2的VEGFA/Chr6比率和每个细胞的平均VEGFA拷贝数≥6.0个信号进行扩增，或VEGFA/Chr6比率≥2.2，每个细胞的平均VEGFA拷贝数≥4.0个信号，如ASCO/CAP指南对乳腺癌中HER2扩增所提出的（Wolff等人，2013）。 Chr6的多基因切割定义为Chr6拷贝数的平均值。当平均值包括在2.26和3.75之间时，多形性6被定义为低，而当平均值> 3.75时，多形性6被定义为高（Andreozzi等人，2014; Sauter al。，2005）。 tapia等人，2007;="" ，2007;="" al。，="" torrisi="" al。，2005;="" salido="" al。，2007;="" wolff="" al。，1995;="">

图1.结肠直肠癌（CRC）中的VEGFA基因座6p12的荧光原位杂交（FITC +罗丹明+ DAPI），（A）非扩增的CRC样品，（B）扩增的CRC样品。红点突出显示VEGFA基因，绿点突出显示Chr6着丝粒。

al。，2005）。 tapia等人，2007;="" ，2007;="" al。，="" torrisi="" al。，2005;="" salido="" al。，2007;="" wolff="" al。，1995;=""> 致谢

al。，2005）。 tapia等人，2007;="" ，2007;="" al。，="" torrisi="" al。，2005;="" salido="" al。，2007;="" wolff="" al。，1995;=""> 我们要感谢Matthias Matter，MD，PhD，Cristina Quintavalle，PhD和Christian Ruiz，PhD，他们在本方法建立阶段提出的建议和批评意见。该协议表示先前使用的版本的修改的增强类型（Sauter等人，1995; Vlajnic等人，2011; Andreozzi等人， em>，2014）。

al。，2005）。 tapia等人，2007;="" ，2007;="" al。，="" torrisi="" al。，2005;="" salido="" al。，2007;="" wolff="" al。，1995;=""> 参考文献

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