材料和试剂

Huh7肝癌细胞（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，目录号：JCRB0403）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：12800-017）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：16000-044）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
质粒; 在pcDNA3骨架中的质粒HBV-P-def中的pcDNA3-GFP的HBV WT C蛋白（STSSSS），在pcDNA3骨架中的质粒HBV-P-def中的pcDNA3主链的磷酸受体位点突变体（ATAAAA，AAAAAA，SSSSSS和ASAAAA）
聚乙烯亚胺（Polysciences，目录号：23966）
Opti-MEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-062）
OptiMEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-070）
透析的FBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：26400044）
1 mCi正磷酸盐（PerkinElmer Inc.，目录号：NEX053）
多克隆兔抗HBc抗体（自制，Jung et al。，2012）
蛋白A/G Plus琼脂糖珠（Calbiochem ，目录号：IP05）
Tris-HCl（pH8.5）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Nonidet P-40（Sigma-Aldrich，目录号：CA630）
NaF（Sigma-Aldrich，目录号：201154）
β-磷酸甘油酯（USB，目录号：155-56-2）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：s6508）
蛋白酶抑制剂（Calbiochem ，目录号：535142）
Tris-HCl（pH6.8）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L-3771）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
甘油（USB，目录号：16374）
裂解缓冲液（见配方）
2x样品缓冲液（见配方）

设备

10cm盘（Corning Incorporated，目录号：430167）
PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：162-0177）

程序

Huh7肝癌细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中，在潮湿气氛下，在37℃，5％CO 2中生长。
细胞每三天传代（在80〜90％汇合时传代），并且在转染前一天将2×10 6个Huh7细胞接种在10-cm培养皿中。
第二天，使用聚乙烯亚胺（PEI）转染Huh7细胞。
PEI转染方法：
1. 在无菌试管中，将总共10μg的质粒DNA与500μlOpti-MEM混合。
2. 加入30微升PEI溶液（1微克/1微升）到DNA-Opti-MEM溶液，然后立即涡旋。
3. 在室温下孵育15分钟。
4. 然后向细胞中加入PEI/DNA-Opti-MEM混合物。
对于转染，使用10μg编码HBV缺失型突变体主链中的HBV STSSSS（WT）或磷酸受体位点突变体C蛋白的质粒。作为转染对照，在转染混合物中包括1μg表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒。
将转染实验重复至少三次。
转染后48小时，Huh7细胞在37℃下在含有10％透析的FBS的10ml DMEM中的5％CO 2培养箱中孵育6小时，然后在37℃下在5％ CO 2正常磷酸盐缓冲液再次培养14小时，每10 7个细胞用250μCi的正磷酸盐处理，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水中，并用1ml裂解缓冲液裂解。（同位素直接加到含有DMEM-dFBS的细胞上）
将裂解物转移到1.5ml管中，在冰上孵育10分钟以进一步裂解，在4℃下以13,000rpm离心2分钟，将上清液转移到新鲜的1.5ml管中。
将上清液裂解物在旋转器上与1μl多克隆兔抗HBc抗体在4℃温育2小时。
接下来，加入15μl蛋白A/G Plus琼脂糖珠，将混合物在4℃下孵育1小时，并以1,500rpm离心10秒。（蛋白A/G Plus琼脂糖珠制备：取15μl珠/样品至新鲜的1.5ml管中，加入1ml裂解缓冲液，短暂涡旋，以1,500rpm离心10秒，弃去上清液重复上述洗涤程序2更多次。）
1.5ml管中的沉淀（含有与放射性标记的WT或突变体C蛋白和抗HBc抗体的免疫复合物结合的珠子）用1ml裂解缓冲液洗涤两次，通过在15μl的乙腈中煮沸（100℃5分钟） 2x样品缓冲液，并通过在13.5％凝胶上的SDS-PAGE分离。在80电压下运行时间为3小时。
将分离的蛋白转移至PVDF膜（250mA 1小时30分钟），并进行放射自显影。

代表数据

与其中磷酸受体位点全部消除为丙氨酸的AAAAAA突变体相比，STSSSS（WT）和其他突变体都是32-标记的。

食谱

裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH8.5） 2mM EDTA 0.5％Nonidet P-40
50mM NaF 25 mMβ-甘油磷酸盐 2mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂
2x样品缓冲液
100 mM Tris-HCl（pH 6.8）
4％SDS
200mMβ-巯基乙醇 0.2％溴酚蓝
20％甘油

致谢

这项工作得到了由韩国政府资助的国家研究基金会资助（NRF-2012-R1A2A2A01015370）的支持。

参考

Jung，J.，Kim，H.Y.，Kim，T.，Shin，B.H.，Park，G.S.，Park，S.，Chwae，Y.J.，Shin，H.J.and Kim，K。用DHBV的C端替代HBV核心蛋白揭示了富含精氨酸的167RRRSQSPRR175结构域是关键的用于HBV复制。 PLoS One 7（7）：e41087。
Jung，J.，Hwang，S.G.，Chwae，Y.J.，Park，S.，Shin，H.J。和Kim，K。（2014）。磷酸受体苏氨酸162和丝氨酸170和178在乙型肝炎的羧基末端RRRS/T基序内病毒核心蛋白对乙型肝炎病毒复制有多重贡献。病毒核心蛋白对乙型肝炎病毒复制有多重贡献。 88（16）：8754-8767。