材料和试剂

来自野生型C57/BL6小鼠（日本SLC）的全血
来自人类志愿者的全血
LPS（大肠杆菌，血清型0111：B4）（Sigma-Aldrich，目录号：L4391）
Polymorphprep ^TM（Axis Shield PoC AS，目录号：1114683）
RPMI 1640培养基（无酚红）（Life Technologies，目录号：32404-014）
胎牛血清（Life Technologies，目录号：12483-020）
ACK（氯化铵 - 钾）裂解缓冲液（Lonza，目录号：10-548E）
Quant-iT TM PicoGreen dsDNA测定试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：P11496）

设备

玻璃巴斯德吸管（Iwaki品牌，Asahi Techno Glass Corporation）
96孔板（TPP Techno Plastic Products AG）
CO ₂孵化器（SANYO）
荧光酶标仪（Perkin Elmer，型号：2030ARVOX）

程序

人类中性粒细胞的分离
1. 从健康人志愿者获得静脉血（每只6ml）。
2. 用中性密度梯度离心分离中性粒细胞根据制造商的说明书制备多晶型物。
3. EDTA抗凝血（最佳浓度为1.5毫克/毫升的血液）铺在6ml Polymorphprep溶液上并离心在500×g下30分钟。
4. 使用玻璃巴斯德吸管小心收获粒细胞级分。
5. 用2ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤含有粒细胞的沉淀。
6. 在400×g离心10分钟，并将沉淀重悬在1ml PBS中。
7. 当存在时，用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。
8. 将1ml ACK裂解缓冲液加入具有残余红细胞的沉淀。
9. 在室温下孵育5分钟，偶尔吸液。
10. 用2ml PBS洗涤含有粒细胞的沉淀。
11. 在400×g离心10分钟。
12. 将嗜中性粒细胞重悬浮于1ml不含酚红的补充有1％胎牛血清的RPMI 1640中。
13. 通过血细胞计数器测定最终嗜中性粒细胞浓度。将获得约0.5〜1.0×10 7个/ml的嗜中性粒细胞。
14. 通过血液涂片上的May-GrünwaldGiemsa染色评价，中性粒细胞纯度被确认为常规> 90％。
15. 简而言之，将空气干燥的涂片载玻片浸入1ml May-Grunwald溶液中1分钟。
16. 加入等份的磷酸盐缓冲液并孵育3分钟。
17. 倒出污渍，用自来水冲洗载玻片。
18. 浸泡在8％Giemsa溶液中20分钟。
19. 用自来水冲洗载玻片并风干。
鼠白细胞的分离
1. 从麻醉的野生型C57/BL6小鼠的下腔静脉中取出肝素化的血液。
2. 简而言之，打开腹部，识别肾脏之间的下腔静脉。
3. 使用25号针头和1毫升注射器充满50微升肝素防止血液凝固。
4. 将针插入静脉，并缓慢抽取血液，直到静脉塌陷。
5. 将获得约500μl血液。
6. ACK裂解缓冲液裂解红细胞。
7. 将5ml ACK裂解缓冲液加入500μl鼠全血中。
8. 在室温孵育5分钟，偶尔轻轻摇动。
9. 在400×g离心10分钟。
10. 小心地弃去含有裂解的红细胞的上清液。
11. （如有必要，重复步骤B6-10。）
12. 用2ml PBS洗涤沉淀。
13. 在400×g离心10分钟，并将沉淀重悬于1ml上述培养基中（步骤A12）。
14. 在ACK处理后，剩余的血细胞包括白细胞（白细胞）和血小板。
15. 通过血细胞计数器测定最终白细胞浓度。将获得约1.0〜2.0×10 6个/ml的嗜中性粒细胞。
LPS引起的嗜中性粒细胞活化
1. 从野生型获得的人嗜中性粒细胞或鼠白细胞将C57/BL6小鼠悬浮于上述培养基中（步骤A12）。
2. 将它们以1×10 4个细胞/孔（100μl）的密度接种到96孔板（第一个板）中。
3. 它们用指定浓度的LPS刺激（2,20,100，和200μg/ml）。将平板置于37℃的潮湿培养箱中 CO 2（5％），6小时。
无细胞NET的定量
1. 因为无细胞的NETs被释放出中性粒细胞，他们是定量为培养上清液中的细胞外DNA。
2. 的收集每孔的培养上清液（100μl）并直接转移到另一个96孔板（第二板）。离心是不需要。
3. 培养上清液中的无细胞NETs 使用Quant-iT TM PicoGreen dsDNA测定试剂盒在培养物上清液中定量为dsDNA。
4. 简言之，将等体积的PicoGreen试剂（100μl）加入到含有培养上清液（100μl）的每个孔中。
5. 将板在室温下避光孵育5分钟。
6. 结合dsDNA的PicoGreen染料使用a 荧光酶标仪。使用以下设置读取 PicoGreen结果：激发波长和带宽为485 nm 和14nm。发射波长和带宽为535nm 和25nm。
7. 计算DNA浓度使用从一系列λDNA标准产生的标准曲线（100μg/ml）。
锚定NET的量化
1. 为了定量锚定到嗜中性粒细胞的锚定的NET，在除去培养上清液后使用第一个平板。
2. 向第一个板的每个孔中加入新鲜培养基（100μl）。一个将等体积的PicoGreen试剂（100μl）加入到每个孔中量化锚定的NETs。
3. 将平板在室温避光保温5分钟。
4. 使用荧光酶标仪测量与dsDNA结合的PicoGreen染料。
5. >使用产生的标准曲线计算DNA浓度从一系列λDNA标准品（100μg/ml）提供制造商。

代表数据

图1.从由LPS激活的人嗜中性粒细胞释放的离体NETs的代表性数据。（A）。在指定剂量的LPS的DNA浓度显示为锚定和无细胞NETs的量的总和。（B）。锚定的NETs的DNA浓度显示在第一个平板上的指定剂量的LPS。锚定的NETs锚定在粘附在板上的嗜中性粒细胞上。（C）。在指定剂量的LPS下显示无细胞NETs的DNA浓度。将它们作为第一板的上清液转移到第二板。

笔记

应该需要温和地吸出上清液以避免锚定的NETs污染到第二板中。

致谢

该协议改编自以前在Tanaka等人（2014）中报道的。这项工作部分得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部赠款（KAKENHI 25462052至K.T.）的支持。

参考文献

Tanaka，K.，Koike，Y.，Shimura，T.，Okigami，M.，Ide，S.，Toiyama，Y.，Okugawa，Y.，Inoue，Y.，Araki，T.，Uchida， Mohri，Y.，Mizoguchi，A.and Kusunoki，M.（2014）。表征小鼠脓毒症的各种器官中的中性粒细胞胞外陷阱模型。 PLoS One 9（11）：e111888。