材料和试剂

（烟曲霉）临床分离物Af293（Nierman等人，2005）
从健康捐献者获得的人pDCs
无酚红的RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875119）
青霉素G /链霉素硫酸盐（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030081）
丙酮酸钠（Life Technologies，Gibco ，目录号：11360070）
无菌蒸馏水（Life Technologies，Gibco ，目录号：10977015）
无菌PBS（Corning Incorporated，目录号：21040CM）
96孔半面板（Corning，Costar ，目录号：07200309）
提示
15ml离心管（Falcon ，目录号：352059）
XTT（Sigma-Aldrich，目录号：X4251）
辅酶Q（Sigma-Aldrich，目录号：D9150）
吐温20（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP337500）
Sabouraud右旋糖琼脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：R454472）
补充介质（见配方）
斜面（见配方）

设备

30μm尼龙网（Genesee Scientific Corporation，目录号：57105）
10ml注射器（BD Bioscience，目录号：305482）
倒置显微镜（尼康）
移液器
多通道移液器
腔室
试剂库（Corning，Costar ^®，目录号：07200127）
具有测量OD 450和OD 650的能力的微孔板读数器（Versamax）
水浴（Thermo Fisher Scientific）
CO 2 培养箱（37℃）
涡旋（Fisher Vortex Genie 2）（Scientisfic Industries，Inc.，目录号：12812）
高压灭菌器

程序

成长A。烟曲霉（Af293）在Sabouraud葡萄糖琼脂斜面上在37℃下培养3-5天。培养物将变成白色作为菌丝生长，然后绿色作为孢子形成（分生孢子形成）发生。
注意：该测定可适用于其他真菌种类。
用2-3ml含0.05％Tween 20的PBS（PBS T20）收获分生孢子，用尖端轻轻地从斜面上除去分生孢子。在用于测定之前，分生孢子可以在4℃保持长达7天。当使用分生孢子时，保持无菌条件。
通过在涡旋上混合几秒钟悬浮分生孢子。将悬浮液吸入10cc注射器。在15ml离心管顶部折叠30μm尼龙网。通过尼龙网过滤分生孢子悬浮液。从离心管中取出并丢弃尼龙网。
通过悬浮在10ml PBS T20中然后以3,000rpm/10min离心来洗涤分生孢子三次
将过滤的分生孢子悬浮在5ml补充的培养基中
在Neubauer室中计数分生孢子。
在96孔半面积平板中每孔加入100μl补充的培养基中的5×10 3个烟曲霉分生孢子。如果需要剂量反应曲线，每孔的分生孢子数目可以改变;然而，较少的分生孢子可能不能提供足够的OD读数
保持板在黑暗中室温（21°C）在静态条件下16小时在补充培养基中膨胀分生孢子，然后在37°C孵育另外3小时，以促进菌丝的发芽。注意，将平板放入孵化器后，每15分钟检查一次发芽过程，直到得到平均长度为10-20微米的菌丝。
当您获得平均长度为10-20微米的菌丝时，从培养箱中取出平板。如果你的pDC没有准备好，保持板在4℃，以避免菌丝的过度生长。我们建议2小时作为在4℃下的最大储存期
用无菌PBS（200μl）轻轻洗涤菌丝2次。
在终体积为100μl的补充培养基中，将5×10 4 pDC加入菌丝中。请注意，您可以使用不同数量的pDCs或其他效应细胞类型。通常，每个条件至少三次测试。保持共培养在无菌条件下。
为了确定背景活性，4至5个孔应仅含有pDC。
为了在不存在pDC的情况下确定真菌的XTT减少，4至5个孔应留下 A。烟曲霉菌丝
为了确定空白值，4到5个孔应该只有培养基。
在37℃下孵育2小时后，通过用100μl蒸馏水洗涤三次来对pDC进行低渗裂解。非常轻柔和小心地进行洗涤以避免移除是至关重要的菌丝。
在37℃下用100μl蒸馏水孵育30分钟
在孵育30分钟期间，必须制备含有400μg/ml XTT和50μg/ml辅酶Q的RPMI-1640。每个含有10mg/ml XTT和辅酶Q的储备溶液应在PBS中单独制备。两种化合物需要高温溶解。通常在60℃水浴中孵育1分钟就足够了。当需要超过1分钟时，重要的是溶解后立即将溶液从水浴（60℃）中取出。在添加到孔中之前，应该将XTT和辅酶加入RPMI-1640几分钟。由于酚红会干扰比色读数，所以RPMI-1640不应含有酚红
取出上清液，再次小心不要取出菌丝。
加入100μl含有400μg/ml XTT和50μg/ml辅酶Q的RPMI培养基，并将孔在37℃下孵育2小时。
在酶标仪上测量OD 450和OD 650。
数据表示为抗真菌活性百分比，按照公式：

OD sub + pDC sub是含有A的孔的OD OD 450 OD OD 650。烟曲霉菌丝与pDC OD pDC 是含有pDC的孔的（OD 450 OD OD 650）。
OD sub是含有A的孔的（OD 450 OD OD 650）。烟曲霉单丝。
OD空白是仅含有培养基的孔的OD OD（OD 450 -OD 650）。< br />

食谱

补充媒体
用100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640（无酚红）
斜线
将4.5沙氏葡萄糖琼脂加入到100ml蒸馏水中高压灭菌15分钟
每15 ml管加入3 ml
将管以45°至60°的角度倾斜并让其固化。保持在4°C直到使用。

致谢

这项工作部分由国立卫生研究院拨款RO1HL112671，RO1AI025780和RO1AI072195支持。 FVL承认Fundaçãode Amparo Pesquisa deSãoPaulo（FAPESP）和Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientíficoeTecnológico（CNPq）的支持。

参考文献

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