材料和试剂

无水乙醇（99.5％）（EMD Millipore，目录号：107017）
甲苯（99.5％）（Merck KGaA，目录号：107019）
乙酰丙酮（99％）（Merck KGaA，目录号：109600）
二恶烷（99.5％）（Merck KGaA，目录号：109671）
发烟盐酸（37％）（Merck KGaA，目录号：101834）
甲醇（99.8％）Merck KGaA，目录号：107018）
超纯水
185（UV）超纯水净化系统（EMD Millipore）。
吡啶（99.5％）（Merck KGaA，目录号：109728）
苯基异氰酸酯（99％）（Merck KGaA，目录号：107255）
四氢呋喃（99.8％）（Merck KGaA，目录号：109731）

设备

锯，带锯，砂带机和木工车床
分析天平（精确到1mg或0.1mg）
用于干燥样品的干燥器和烘箱（设置为50±3℃，70±3℃和105±3℃）。
Polymix（Kinematica，型号：PX-MFC 90D）
Analysette 3振动筛摇床（Fritsch）
索格利特萃取装置（Sigma-Aldrich，目录号：64825）
沸腾烧瓶（50ml）（Sigma-Aldrich，目录号：Z418773）
水浴（Harry Gestigkeit Gmbh，型号：W 16）
中等孔隙率（16-40μm）的烧结玻璃过滤坩埚（VWR International，目录号：511-2403）
滴加烧瓶（50ml）（Smith Scientific Limited，目录号：8029/50）
高效液相色谱系统（脱气机，泵，自动进样器，加热器和二极管阵列）（Agilent Technologies，型号：1200系列）
Captiva Premium注射器过滤器（0.45mm PTFE膜，15mm）（Agilent Technologies，目录号：5190-5085）
PLgel（10μm，7.5×300mm，两片）（Agilent Technologies，型号：MIXED-B柱）
PLgel（10μm，7.5×50mm）（Agilent Technologies，型号：Guard-column）
固态NMR光谱仪（Varian，型号：400-MHz），具有以下组件（图1）：
磁体：超导主动屏蔽磁体， B <= 9.4 T，宽孔 - 89 mm
控制台：三个高功率线性射频通道，全部具有自旋锁和去耦能力，输出功率高达1000 W，
1. 通道 - 高频带RF，窄带放大器375-400 MHz
2. 通道 - 宽带放大器18-240 MHz
3. 通道 - 宽带放大器10-130 MHz
探针：
a：¹ H 19 F 31 Na- 15 N，对于固体，4mm T3-HXY，双重和三重共振，MAS高达18kHz。
b：¹ H 19 > Na- 15 N，对于固体，7.5mm T3-HXY，双重和三重共振，MAS高达7kHz
c：双通道测量静态HX探头
X通道-5,10mm线圈，从³¹ P到¹⁵ N的共振
附件：
可变温度控制单元，范围-150°C↔+250°C
用于低频带测量的附件 - 从¹⁵ N向下
样品制备和测量附件：
一个。 ZrO转子，直径为4和7.5毫米
b。转子包装和清洁工具，异丙醇，液氮
C。样品水合和脱水装配
d。 NMR ppm标度校准的主要和次要标准

图1.固态¹³ C MAS NMR设备

软件

LC 3D系统化学工作站（Agilent Technologies）
Clarity，GPC模块，版本5.0.3.180（DataApex）
VnmrJ 3.2（Varian）
Mnova 8.1或更高版本（Mestrelab Research）

程序

根据Seifert方法从受感染树木的茎上分离纤维素
1. 选择受荷兰榆树病影响的榆树（图2A和2D）并从茎上看到几块木盘，大约4厘米厚乳房高度在树基地上130厘米。如果分叉不允许光盘在这个高度从茎上取样，样品木圆盘在最高处可能的位置在茎上下叉。不同的感染区的特征在于木材的变色（图2B和2E）真菌菌丝生长并通过次生木质部导管扩散（图2C和2F）。
  
  图2.荷兰榆树病（DED）和感染区在荷兰榆树杂种'Groeneveld'（易受DED， A-C）和"Dodoens"（耐受DED，D-F）用致病真菌的孢子接种新的Ophiostoma novo-ulmi ssp。 x novo-ulmi 。树。 B.从易感树上锯下的木盘，其中感染区域（用红色箭头标记）限于年轮今年。早在下面的生长季节接种后这些感染的树死了。 C.真菌菌丝生长的证据感染区内的深木船。横截面扫描电子显微镜，比例尺=50μm。 D.DED的症状减轻感染的耐受树。 E.从一棵宽容的树上锯下的木盘存活的感染。感染的树木继续生长没有任何生理弱化在接下来的几年。变色的感染区域由红色箭头标记。 F.偶尔发生的真菌菌丝（白色箭头）生长在感染内的木材船内区。在扫描电子显微镜中的径向截面，比例尺= 50 μm。
2. 分离涉及到的年轮环节感染区从木盘使用带锯，砂带机和木工车床。有关详细信息，请参阅视频1。分解和提取的木材只来自年轮的这些部分进行尺寸排阻色谱和13 C核磁共振测量。另外，分开相同的年轮从控制树的部分，使大分子的比较感染树木和非感染树木之间的纤维素性状
  
  视频1.涉及感染区域的年轮环节的分离
3. 使用Polymix PX-MFC 90D磨机将分离的木材部分分解成锯末
4. 筛分锯屑至所需分数（尺寸0.50-1.00mm），并在干燥器中干燥
5. 提取干锯屑（每250ml提取溶液5g）样品），根据ASTM国际标准程序D1107-96 （2013）在具有乙醇 - 甲苯的索格利特萃取装置中溶液（1L无水乙醇和427ml甲苯）6小时
6. 将提取的锯屑在台面上的空气中干燥过夜，然后在50±3℃的真空下干燥至少4小时。
7. 将干木屑（1g），乙酰丙酮（6ml），二恶烷（2ml）和盐酸（1.5ml）装入50ml沸腾烧瓶中
8. 热该烧瓶在回流下使用沸水浴30分钟，然后允许将混合物缓慢冷却至接近室温并加入甲醇（30-40ml）在通风橱中
9. 在105±3℃的烘箱中干燥过滤坩埚2小时，然后在干燥器中冷却至室温并称重。
10. 将混合物过滤通过之前称重的过滤坩埚。使用以下顺序缓慢冲洗固体：甲醇（100ml），随后加入热水（40ml），二恶烷（40ml），最后加入甲醇（50ml）。在过滤期间，轻轻施加真空以除去任何液体。每次冲洗步骤约需2分钟。
11. 干燥坩埚和酸不溶性残余物（即Seifert's纤维素） 3℃直至达到恒重，通常至少90分钟。
纤维素三鸟氨酸酯的尺寸排阻色谱法（SEC）
1. 将塞夫特纤维素（50mg），吡啶（8.0ml）和异氰酸苯酯（1.0ml）放入50ml滴液烧瓶中。
2. 将密封的烧瓶置于油浴中，在70±3℃的烘箱中加热72小时
3. 冷却至室温，加入甲醇（2.0ml）以除去任何过量的异氰酸苯酯
4. 将黄色溶液滴加到快速磁力搅拌的甲醇：水（7:3）混合物（150ml）中
5. 滤出沉淀，用甲醇：水（7:3）混合物洗涤（1×50ml），然后用水（2×50ml）至中性反应（pH = 7.0）。
6. 在台面空气中干燥三萘胺酸纤维素（CTC）过夜，然后在50±3℃下真空干燥。
7. 将CTC（2.0mg）溶于四氢呋喃（THF）（2.0ml）中滤液通过Puradisc 25 NYL注射器过滤器（孔径0.45μm）使用5 ml注射器进入自动进样器样品瓶
8. 注入样品（10μl）加入到色谱仪中，并通过SEC在下面进行分析条件：温度35℃，流动相（THF）流速1.0 ml/min，在两个PLgel，7.5×300mm，在PLgel之前的MIXED-B柱上， 7.5×50mm，保护柱
9. 使用化学工作站获取数据软件，然后将数据从Chemstation导入Clarity 软件。计算分子量（ M _n， M _w z ， _p），度数的聚合（DP w）和纤维素的多分散指数（PDI）样品，并比较纤维素的分子量分布感染和非感染树之间的三氨基甲酸酯（图 3）。
图3.从荷兰榆叶杂种'Dodoens'的未感染和感染的树制备的纤维素三鸟氨酸酯的分子量分布的尺寸排阻色谱。由产生的纤维素分解酶>。 novo-ulmi ssp。美国 x novo-ulmi 负责大多数中等分子量的纤维素大分子的降解（DP w 值约为235至238）导致低分子量大分子（色谱图的左侧）的显着增加。然而，同时，受感染的树对感染作出响应，纤维素的高分子量大分子（色谱图的右侧）的生物合成显着增加，随后峰的移动（M < em> p 值）到高分子量区域。共生的生物合成和生物降解过程导致改变纤维素的大分子性状（ _z， _{z + 1}，DP ，PDI）
固态13 C MAS NMR
1. 对于^{13 C MAS NMR测量，开始校准化学位移标度（ppm）并测量的13 C MAS NMR光谱金刚烷}
2. 用粉碎和压实的提取的锯屑样品填充4mm ZrO转子（体积为52μl）。
3. 将转子插入T3-HXY探头的定子，用于固体，插入将探头插入磁铁孔，并使转子旋转至10°的速率 kHz。
4. 调谐探头的¹ H和¹³ C通道
5. 设置 "onepul"脉冲序列的参数（图4）-π/2-脉冲宽度，发射器和去耦器偏移，频谱宽度，去耦类型和功率和采集时间。
图4.使用的脉冲序列的方案 - 一个脉冲+偶极解耦+在魔角下的样品旋转
1. 测量并记录自由感应衰减（FID）。
2. 使用Mnova 8.1软件，或更高版本，用于傅立叶变换 FID，以及FID和NMR光谱处理。软件和随附的帮助手册都可以从Mestrelab下载研究网站：http://mestrelab.com/software/和 http://mestrelab.com/software/mnova/manuals/。
3. 比较信号在83ppm（对应于无定形纤维素的C 4+碳原子）和89ppm（对应于C 4亚烷基）的两者的13 C MAS NMR光谱的强度>结晶纤维素的碳原子）非感染树（图5）。基于峰值高度，计算结晶度指数和无定形和二者的百分比损失结晶区。
图5.来自荷兰榆树杂交'Dodoens'的未感染和感染的树的无提取物样品的固态13 C MAS NMR光谱。在83位的信号ppm和89ppm对应于C 4 4碳无定形和结晶纤维素的原子。在两个共振的信号强度的降低揭示了结晶（26.09％下降）和非结晶（5.26％下降）纤维素区域的损失平行发生。

笔记

我们已经发现，木质素中丁香酰基与愈创木基（S/G）的比率通过O x影响纤维素的降解性。，，，其他最近的研究还表明，S/G比率对木质素和其他细胞壁组分之间的交联有显着的影响，从而改变细胞壁的微观结构和表面化学，化学和热水中的细胞壁降解性预处理，以及纤维素连续水解成葡萄糖（Li等人，2010; Studer等人，2011; Papa等人，，2012）。因此，我们建议使用标准分析方法，如碱性硝基苯或铜氧化，NMR，热解气相色谱 - 质谱（Py-GC-MS）或其他，以确定由S/G比定量的木质素单体组成。因此，木质素单体组合物和纤维素降解数据都可以提供由纤维素降解真菌引起的生物降解过程的更完整的视图。

致谢

作者感谢MiloňDvořák博士，JanaKrajňáková博士，MiroslavaMamoňová博士，IngridČaňová博士，Jaroslav Ohanka博士和MiroslavRusnák先生提供的技术援助。这项工作由斯洛伐克科学赠款资助代理VEGA（1/0149/15）。这个协议是从我们以前的工作（Ďurkovič，，2014）。

参考文献

ASTM D1107-96。（2013年）。木材乙醇 - 甲苯溶解度的标准测试方法。美国国际测试与材料协会， West Conshohocken，PA。
Ďurkovič，J.，Kačík，F.，Olčák，D.，Kučerová，V.和Krajňáková，J.（2014）。荷兰榆树杂交种中木材成分的主体反应和代谢分布与荷兰榆树病的对比耐受性。 Ann Bot 114（1）：47-59。
Li，X.，Ximenes，E.，Kim，Y.，Slininger，M.，Meilan，R.，Ladisch，M.and Chapple，C。（2010）。木质素单体组成影响液体热水预处理后的拟南芥细胞壁降解性 em> 3：27.
Papa，G.，Varanasi，P.，Sun，L.，Cheng，G.，Stavila，V.，Holmes，B.，Simmons，B.A.，Adani，F.and Singh，探索不同植物木质素含量和组成对离子液体预处理效率和酶糖化的影响 > Eucalyptus globulus L.mutants。 Bioresour Technol 117：352-359。
Studer，M.H.，DeMartini，J.D.，Davis，M.F.，Sykes，R.W.，Davison，B.，Keller，M.，Tuskan，G.A。和Wyman，C.E。天然变体中的木质素含量会影响糖释放。 Proc Natl Acad Sci USA 108（15）：6300-6305。