材料和试剂

C。 glabrata 株（ATCC2001，临床分离株）
无菌水（双蒸）
Bacto TM蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211820）
Bacto TM酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212720）
Bacto TM琼脂（BD Biosciences，目录号：214030）
Difco TM酵母氮源（YNB）（BD Biosciences，目录号：233520）
葡萄糖（Merck KGaA，目录号：108337）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A8626）
L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006）
L-酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3754）
L-异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：I2752）
L-苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126）
L-谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G1251）
L-天冬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9256）
L-苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8625）
L-丝氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：S4500）
L-缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0500）
L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
YPD介质（参见配方）
固体YPD介质（参见配方）
2x YPD介质（参见配方）
SC介质（参见配方）
固体SC介质（参见配方）
氨基酸混合物（见配方）
15％甘油溶液（见配方）

设备

方形板（PlusPlate）（40ml /板）（Singer Instruments，目录号：PLU-001）
Pin Pad（RePad 96 Long）（Singer Instruments，目录号：REP-001）
96孔板（200μl/孔）（Starlab，目录号：CC76827596）
培养皿（92mm）（SARSTEDT AG，目录号：82.1473）
培养管（Starlab，目录号：I14850810）
酵母复制机器人（Singer Instruments，目录号：RoToR HDA）
读板器（Victor ^{3）（PerkinElmer，目录号：1420040）}
48孔复制印模（V& P Scientific，目录号：VP 408H）
96孔复制印模（V& P Scientific，目录号：VP407）
图书馆复印机（邮票指南）（V& P Scientific，型号：VP 381）
板混合器（Eppendorf，目录号：5353000014）
用于培养瓶的旋转振荡器（innova44）（New Brunswick Scientific，目录号：M1282-0002）
孵育器（Heraeus Instruments，目录号：B6120）

程序

阵列和存储
1. 对于在96孔格式中排列缺失菌株，参见注释部分。阵列菌株可以悬浮在15％甘油中并储存在96孔板中于负70℃冷冻。
2. 冷冻库存可以通过手动复制工具或通过自动化系统处理例如Singer Instruments的RoToR HDA。后者提供了更高的重现性，并降低污染的风险手动系统。因此，这个大规模筛选的协议优化了与歌手HDA RoToR复制机器人的工作
初始大规模筛选（在实体YPD培养基上）
1. 对于初始试验筛选，制备方形板筛选化合物和缺少如图所示的化合物的对照板图1.用于固体筛选的化合物的浓度板通常是IC 50的浓度的两倍。但是，确切浓度应在大规模筛选前确定通过电镀控制株
  1. 要排除复制电镀错误，请至少两个板应准备每个条件（应激诱导化合物，应激诱导介质，温度，等）。
  2. 来源板可以是液体培养基（96孔微量滴定板）或固体培养基（正方形板）。
2. 干板在干净的工作台上10分钟，对于光敏化合物关闭灯。
  1. 确保在使用之前，板或盖子上没有冷凝水滴。
  2. 标记板前点样菌株。
    使用Singer机器人时，在ROTOR HDA软件中使用以下设置：
  3. 对于固体源板激活"偏移"功能，以避免针从完全相同的斑点接收细胞。
  4. 如果使用液体源板，请启用"湿混合"选项软件菜单（直径：1mm;速度：3mm /秒;循环：1;行程：2D）。或者，液体源板可以在MixMate上振荡15分钟秒，750rpm
  5. 如果所谓的RePads用于多个目标盘（"回收模式"），"再访源"选项应该启用。
3. 电镀后，立即将板倒置斑点已干燥。在固体源板的情况下，目标板可以立即转身。孵育板在30°C下72小时，不摇动并检查集落生长。应拍摄每张照片 24，48和72小时。视觉比较每个突变株的生长和控制胁迫下和无胁迫与野生型的生长应变。应该考虑的重点如下所示图2和图3。
连续稀释点测定（固体SC培养基）
1. 对于精制筛选，为每个至少制备两个SC培养基板条件。在使用前，在干净的工作台上干燥。成长过夜培养来自96孔筛选的敏感型和野生型菌株在SC培养基中在30℃下以200rpm振荡（200rpm）培养管中的生长; 每种培养物的总量为5ml 足够）。将培养物稀释到新鲜的SC培养基中，导致OD 600约为0.2，并将它们再生至OD≈1.0的600。准备1:10连续在96孔板中的无菌水中的缺失菌株的稀释液，从OD ₆₀₀为0.1开始。
  
  表1.细胞的系列稀释
  
  OD ₆₀₀
  稀释
  单元格/m
  
  0.1
  1：1
  3 x 10 ⁶
  
  0.01
  1:10
  3 x 10 ⁵
  
  0.001
  1：100
  3 x 10 ⁴
  
  0.0001
  1：1,000
  3 x 10 ³
2. 点样使用48孔金属针复制器，也称为"frogger"或"料斗"。
  1. 通过将销浸没在EtOH中和短暂燃烧灭菌工具在本生灯。重复这个过程三次，让针冷却。
  2. 使用在96孔板中连续稀释复制器并从孔中收回销而不接触墙的井。
  3. 细胞悬浮液液滴将保留在复制器的每个末端上。
  4. 将复制器放在一个新的筛板上，然后使用温柔压力。向上提起复制器，避免角度重复过程为其他板。
  5. 如上所述在步骤B3孵育平板，并在孵育24,48和72小时后拍摄每个平板的照片。
3. 或者，可以使用多通道或a 单通道移液器。使用移液器时，应放置网格在板下，以确保液滴放置在一条直线上
4. 滴剂干后，将盘子倒置并孵育它们在30℃下72小时而不摇动。比较串行的增长在胁迫下每个突变体和野生型对照的稀释度没有压力。
微量稀释化合物（液体介质）
1. 生长过夜的缺失培养物并控制野生型菌株 YPD在30℃下以200rpm振动（如步骤C1中所述，200rpm 用于培养管; 每种培养物5ml是足够的）。稀菌株在新鲜YPD培养基中，导致OD 600约为0.2并再生长直到OD <600>≈1.0。稀释细胞悬浮液在2x YPD中最终浓度为2.5×10 3个细胞/ml
2. 准备一系列十两倍稀释的待测化合物在无菌水中。填每孔加入100μl化合物稀释液或水。第11行和第12行应仅含无菌水并用作生长和不生长控制
3. 添加100微升细胞悬浮液在2x YPD的孔中 96孔板。使用透明透气箔密封板，孵化平板在30℃下振荡48小时。在a上测量OD ₆₀₀ 24和48小时后。在读板之前，混合1000 rpm，15秒。计算获得50所需的化合物浓度％生长抑制（IC 50）。
结果评价
1. 由于大规模筛选可能导致假阳性命中，它需要对主要结果进行独立的无偏见检查。因此，在C-D节中描述的筛选应该是独立的至少由两个人分析
  
  图1.筛选过程 - 从大规模到单一菌株。推定命中（紫色，蓝色，粉红色）通过比较对照板上菌株的生长来鉴定（仅YPD）与补充筛选化合物的板。在此外，缺失菌株必须与相应的野生型比较类型（前两行）。然后将这些菌株用于精制在液体测定中通过在固体培养基上连续稀释进行筛选确认原发性表型
2. 验证a之间的链接基因型和表型更多的实验是必要的。这些实验包括缺失菌株的互补和在不同背景中缺失单个基因。

笔记

版面布局
在设计布局时，应考虑几个方面外点增长更快。
外部斑点在图2中呈红色，并且与内部行和列中的斑点相比显示更快的生长

图2.外部点的更快速增长

这种现象可能妨碍缺失菌株的生长表型与野生型菌株的生长的比较。在最坏的情况下，这可能导致缺失相关表型。这个问题可以通过用虚拟应变（例如。野生型）填充所有外部行/列来解决。因此，所有待筛选的菌株在所有侧面被包围并经历相同的生长条件。值得注意的是，这个过程只产生60个可用点。或者，可以使用Singer HDA RoToR，以384-孔格式每个缺失一式四份地点样96孔板。该方法将导致每个缺失菌株在琼脂平板上点样4次，如图3所示。

图3. 96孔至384孔格式。与96孔格式（左图）相比，384孔格式（右图）提供了两个明显的优势。只有外部斑点生长更快，因此每个原始斑点至少有一个斑点现在正常生长。此外，由于生长模式的均匀外观，可以更容易地鉴定生长表型
包括控制空白点
为了比较结果，至少背景应变应当在每个板上点样。由于该菌株通常来源于野生型菌株，因此也应包括野生型菌株。此外，在每个平板上包括空白点并添加额外的阳性和阴性对照菌株用于特定筛选是非常有用的。例如，对于特定筛选，作为阳性对照临时添加已知的过敏性菌株可能是非常有帮助的[对于azole筛选，pdr1Δ（CAGL0A00451g）菌株是一个很好的控制]。br/>
液体源板优于固体源板，因为当使用液体源板时的再现性更高。我们经历，当使用固体源板时，细胞的量可能不一致。液体源板可以在电镀之前摇动，导致非常均匀的源细胞悬浮液
存在各种用于微量稀释测定以量化药物敏感性的标准化方案，包括临床和实验室标准研究所（Fothergill等人，2011）或欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（Arendrup et al。，2012）。
正在使用的歌手RoToR的视频在以下位置提供：
https://www.youtube.com/watch?v=1JabqneqXPE 。
水不溶性化合物的储备液可以在合适的溶剂（例如 DMSO）中制备。然而，稀释应在水中进行。否则，孔将含有高达50％的溶剂。

食谱

YPD培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）
25g/L Bacto TM蛋白胨 12.5g/L Bacto TM酵母提取物
2％葡萄糖
实体YPD介质
25g/L Bacto TM蛋白胨 12.5g/L Bacto TM酵母提取物
2％葡萄糖 2％琼脂糖
2x YPD媒体
50g/L Bacto TM蛋白胨 25g/L Bacto TM酵母提取物
4％葡萄糖
SC介质（合成完成）
3.4g/L Difco TM YNB
2.9g/L氨基酸混合物
2％葡萄糖
固体SC介质
3.4g/L Difco TM YNB
2.9g/L氨基酸混合物
2％葡萄糖 2％琼脂糖
氨基酸混合物（g/11.7g总混合物）
0.4克腺嘌呤
0.2克L-精氨酸 0.3克L-酪氨酸 0.3克L-异亮氨酸 0.5克L-苯丙氨酸 1.0g L-谷氨酸 1.0g L-天冬氨酸 2.0克L-苏氨酸 4.0克L-丝氨酸 1.5克L-缬氨酸 0.5克L-甲硫氨酸
15％甘油溶液
150ml/L甘油 850 ml/L水

致谢

这项工作得到奥地利科学基金会FWF通过ERA-Net Pathogenomics项目FunPath（FWF-API-0125）的支持，部分得到了基督教多普勒学会，FP7 EC项目FUNGITECT，Marie-Curie ITN ImResFun MC-ITN-606786）和FWF Project FWF-P25333"染色质"

参考文献

Arendrup，M.C.，Cuenca-Estrella，M.，Lass-Florl，C.，Hope，W。和Eucast，A。（2012）。 EUCAST技术说明EUCAST定义文件EDef 7.2：用于测定酵母菌的抗真菌剂的肉汤稀释最小抑制浓度的方法EDef 7.2（EUCAST-AFST）。临床微生物感染 18（7）：E246-247。
Fothergill，A.W。（2011）。抗真菌药敏试验：临床实验室和标准研究所（CLSI）方法酵母，霉菌和抗真菌代理 65-74。
Schwarzmuller，T.，Ma，B.，Hiller，E.，Istel，F.，Tscherner，M.，Brunke，S.，Ames，L.，Firon，A.，Green，B.，Cabral， Marcet-Houben，M.，Jacobsen，ID，Quintin，J.，Seider，K.，Frohner，I.，Glaser，W.，Jungwirth，H.，Bachellier-Bassi，S.，Chauvel，M.，Zeidler， U.，Ferrandon，D.，Gabaldon，T.，Hube，B.，d'Enfert，C.，Rupp，S.，Cormack，B.，Haynes，K.and Kuchler，K。大型的假丝酵母（Candida glabrata）缺失集合的系统表型揭示了新的抗真菌耐受基因。 PLoS Pathog 10（6）：e1004211。