材料和试剂

苔藓的7天龄的质子。 patens
液氮
Tris-HCl（pH7.5） - 饱和酚（AMRESCO，目录号：K168）
乙酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
DTT（Promega Corporation，目录号：V3155）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：650501）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I6125）
碳酸氢铵（pH8.5）（Sigma-Aldrich，目录号：40867）
胰蛋白酶（Promega Corporation，目录号：V5111）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S5390）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6635）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Promega Corporation，目录号：V3155）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
NH 4 OH（Sigma-Aldrich，目录号：320145）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U6504）
CHAPS（Sigma-Aldrich，目录号：C9426）
乙腈（ACN）（Sigma-Aldrich，目录号：34851）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：302031）
谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G0355000）
蛋白质提取缓冲液（参见配方）
蛋白质重悬缓冲液（见配方）
加载缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液I（见配方）
洗涤缓冲液II（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

瓷砂浆和杵（90毫米）
管和试管架（2 ml）
二氧化钛微柱（320μm×50mm）（Column Technology，Freemont）
离心机
涡流
冷冻干燥机（基督，型号：Alpha 1-4 LSC）

程序

该程序包括蛋白质提取，蛋白质消化和磷酸肽纯化。以下应在冷室温下进行，除了特殊说明。

根据制造商的说明，将蛋白酶抑制剂混合物（蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）加入冰冷的蛋白提取缓冲液中。
将液氮倒入砂浆中，直到几乎完全，以预先冷却砂浆和杵。
将新鲜或冷冻（-80℃冷冻）的组织（约1g）加入到研钵中，在液氮中研磨成细粉，然后在冰上解冻10-15分钟。
加入2毫升冰冷的蛋白质提取缓冲液在砂浆中，通过在冰上研磨10分钟，然后转移0.8毫升到每个管。
向每个管中加入等体积的冰冷Tris-HCl（pH 7.5）饱和酚，涡旋管5-10分钟。
在4℃下以13,000rpm离心样品15分钟
收集苯酚相并与三体积的100mM乙酸铵的甲醇溶液混合。
在-20℃下从苯酚相和100mM乙酸铵的混合物中沉淀蛋白质过夜
在4℃下以13,000rpm离心15分钟蛋白
用含13mM DTT的冰冷丙酮冲洗蛋白质3次，然后用冷冻干燥器冻干5-10分钟。
蛋白质浓度根据Peterson（1977）使用BSA作为标准来确定
在室温下在100μl蛋白质重悬浮缓冲液中溶解500μg蛋白质功率
用20mM DTT在37℃下减少蛋白质（500μg蛋白质，在100μl重悬缓冲液中）2.5小时，烷基化蛋白质与40mM碘乙酰胺在室温下在暗处培育40分钟。
用1ml 100％丙酮在-20℃下沉淀蛋白质混合物过夜
通过离心收集蛋白质，将蛋白质溶解在100mM碳酸氢铵（pH8.5）中，并用胰蛋白酶（50:1w/w，蛋白质/胰蛋白酶比）在37℃消化蛋白16小时。
冻干消化的肽混合物，然后在200μl上样缓冲液中稀释
用100μl上样缓冲液冲洗二氧化钛微柱（TiO 2柱，320μmx 50 mm）。
通过使用塑料注射器产生的空气压力将200μl样品加载到TiO 2柱上
用100μl上样缓冲液，100μl洗涤缓冲液I，最后用100μl洗涤缓冲液II洗涤TiO 2柱。
用100μl洗脱缓冲液洗脱结合磷酸肽的柱子
池和冷冻干燥磷酸肽的纯化的洗脱液[代表性数据显示在Wang等人（2014a）和Wang等人（2014b）]。

食谱

蛋白提取缓冲液
250mM蔗糖 20mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM EDTA 1mM 1,4-二硫苏糖醇蛋白酶抑制剂鸡尾酒
磷酸酶抑制剂鸡尾酒2
蛋白质重悬缓冲液
8 M尿素
4％CHAPS
65 mM DTT
40mM Tris-HCl（pH7.5）
加载缓冲区
65％ACN和用谷氨酸饱和的2％TFA溶液
洗涤缓冲液I
65％ACN
0.5％TFA
洗涤缓冲液II
65％ACN
0.1％TFA
洗脱缓冲液
300mM NH 4 OH v/v 50％ACN

致谢

这项工作得到了部科学技术项目赠款的支持。中国科学技术（2013CB967300，2007CB948201）教授，中国国家自然科学基金（31371243,30970250），中国博士后科学基金和国家教育部退出侨团科学研究基金会王博士。

参考文献

Peterson，G.L。（1977）。 Lowry等人的蛋白质测定方法的简化，这是更普遍适用。 Anal Biochem 83（2）：346-356。
Wang，X.，Qi，M.，Li，J.，Ji，Z.，Hu，Y.，Bao，F.，Mahalingam，R.and He，Y.（2014a）。从小立碗藓再生原生质体中的磷酸化蛋白表现出与胚胎发育并行的变化在高等植物中。 65（8）：2093-2106。
Wang，X.Q.，Yang，P.F.，Liu，Z.，Liu，W.Z.，Hu，Y.，Chen，H.，Kuang，T.Y.，Pei，Z.M.，Shen，S.H.and He，Y.K。通过蛋白质组学策略探索小立碗藓的干扰耐受性。/a> Plant Physiol 149（4）：1739-1750
Wang，X.，Zhou，S.，Chen，L.，Quatrano，R.S。和He，Y.（2014b）。青苔中发育重编程的磷酸蛋白质组学分析小立碗藓。 J Proteomics 108：284-294。