材料和试剂

Alexa700缀合的小鼠抗人CD7克隆124-1D1（eBioscience，目录号：56-0079-42）
K562细胞系（由Lewis L.Lanier博士提供，加利福尼亚大学，旧金山，美国）注意：这些也可以从ATCC购买，目录号为CCL-243。
藻红蛋白（PE） - 德克萨斯红（ECD） - 缀合的小鼠抗人CD3克隆UCHT1（Beckman Coulter，目录号：IM2705U）
ECD-缀合的小鼠抗人CD14克隆RMO52（Beckman Coulter，目录号：IM2707U）
PE-Cy7缀合的小鼠抗人CD56克隆NCAM16.2（BD Biosciences，目录号：335791）
太平洋蓝标记的小鼠抗人CD16克隆3G8（BD Biosciences，目录号：558122）
APC-Cy7缀合的小鼠抗人CD19克隆SJ25C1（BD Biosciences，目录号：557791）
荧光素异硫氰酸酯（FITC）结合的小鼠抗人CD107a克隆H4A3（BD Biosciences，目录号：555800）
APC缀合的小鼠抗人IFNγ克隆B27（BD Biosciences，目录号：554702）
人IgG（Sigma-Aldrich，目录号：I4506）
抗小鼠免疫球蛋白G包被的补偿珠（BD Biosciences，目录号：552843）
胺水反应性染料（AARD）（Life Technologies，目录号：L34957）
96孔U底板（Corning，目录号：353077）
96孔V底板（Corning，目录号：3894）
RPMI（生命技术，目录号：11875）
L-谷氨酰胺200mM（100x）（Life technologies，目录号：25030）
青霉素（10,000单位/ml） - 链霉素（10,000μg/ml）（Life technologies，目录号：15140）
胎牛血清（Hyclone，目录号：SH30071）
来自斯坦福血液中心的血沉棕黄层用于获得外周血单核细胞（PBMC）
Ficoll-Paque Premium（GE Healthcare，目录号：17-5442-03）
来自旧金山的HIV-1感染的队列范围和选项的冷冻保存的PBMC样品
重组IL-12（Peprotech，目录号：200-12）
重组IL-18（MBL& Biological Laboratories，目录号：B001-5）
来自布鲁氏菌Penicilium brefeldianum的Brefeldin A（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
BD高尔基体蛋白转运抑制剂含有莫能菌素（BD Biosciences，目录号：554724）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Teknova，目录号：E0306）
牛血清白蛋白（BSA）（Gemini BioProducts，目录号：700-100P）
16％多聚甲醛（PFA）（Electron Microscopy Science，目录号：15710）
BD FACS Permeabilizing solution 2（BD Biosciences，目录号：340973）
细胞培养级水（HyClone，目录号：SH30529.02）
脱氧核糖核酸酶（DNase）I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
15ml锥形瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-539-5）
PBS（0.4％w/v）（Corning，目录号：25-900-CI）中的台盼蓝
完成媒体（见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
多聚甲醛食谱（见配方）

设备

生物安全柜（Nuaire，型号：407FM600）
37℃水浴（Cole Parmer）
校准的单通道和多通道移液器
助洗剂
提示（10μl，20μl，200μl，1,000μl）
离心机（Beckman Coulter，Allegra 6R，转子GH-3.8）
37℃孵育器（Thermo Forma，型号：3110）
用于计数细胞的尼康Optiphot显微镜
用于计数细胞的血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1490）
4激光（405nm，488nm，532nm和633nm）BD LSR-II

软件

FlowJo单细胞分析软件

程序

从冷冻保存中回收外周血单核细胞（PBMC）
1. 在解冻前在37℃水浴中加热完全培养基。
2. 将冷冻小瓶的冷冻保存的PBMC从冷冻冻存器转移到37℃ °C水浴并轻轻地在水中来回移动管，允许小瓶的内容物解冻，直到只有小的剩余冻结量。不要离开冷冻无人看管解冻过程。解冻约需1-2分钟。
3. 在一个生物安全柜，从冷冻管中取出液体并放入 15ml锥形管，使用2ml血清移液管和移液器
4. 缓慢加入10ml预热（37℃）培养基至15ml 锥形管。在添加介质时轻轻弹动管，以确保液体混合良好。
5. 盖上管并在预冷的4℃离心机中以330×g离心5分钟。
6. 倾析上清液，通过轻拂管破碎沉淀物，和重悬于10ml含有DNase（0.01mg/ml）的完全培养基中计数单元格
7. 混合10微升细胞与10微升台盼蓝。取10μl的混合物，放在血细胞计数器上计数。
8. 在4℃下以330×g离心细胞5分钟，倾析上清液，通过轻拂管破碎细胞沉淀，并重悬在完全含有浓度为5百万个细胞/ml的DNA酶的培养基。
在96孔U底板中通过单通道移液管在100μl板中每孔500,000个PBMC 注释：用于刺激的替代方案：解冻的PBMC可以在37℃和5％CO 2下孵育过夜（16-20小时）。补充有200IU/ml人重组IL-2（NCI BRB Preclinical 存储库）。这显着增加NK细胞对靶细胞刺激的反应性;然而，在IL-2中培养过夜也可以改变NK细胞的表型。需要考虑实验的期望读数在主协议和这种替代方法之间的选择。
使用单通道移液管以1:50的稀释度（即在200μl培养条件中的4μl）将FITC缀合的抗CD107a抗体加入含有细胞的96孔板的所有孔。
注意：
1. 此抗体的稀释度应与特定的血细胞计数器一起使用。
2. 每个孔中的最终体积应为200μl。将有100微升的PBMC和100μl靶细胞（K562）或100μl细胞因子混合物。
对于靶细胞刺激（即，K562），计数并悬浮500,000个K562细胞于1ml含有DNase的完全培养基中，并使用单通道移液管加入50,000个靶细胞（100μl）井
对于细胞因子刺激，以每孔细胞因子10ng的终浓度添加IL-12和IL-18。加入1微升的每种细胞因子到998微升含有DNA酶的完全培养基中。使用单通道移液器加入100微升/孔到适当的井进行刺激。
使用多通道移液器小心吸取上下3次，小心不要使气泡混浊，以混合所有孔。
将板在孵育器中在37℃和5％CO 2下孵育1小时
1小时后，在25℃离心机中以330×g离心板离心
从每个孔中删除50μl上清，小心不要打扰细胞沉淀。为了不干扰沉淀，以45-60°的角度倾斜板，并使用多通道移液器，将尖端放置在孔的侧面，并缓慢地移除液体。可以弃去上清液。
准备含有布雷菲德菌素A（BFA）和GolgiStop（莫能菌素）混合物的主混合物。
1. 稀释GolgiStop 7.8μl到42.2μl含0.01mg/ml DNA酶的完整培养基
2. 做一个主混合：20微升10毫克/毫升布雷菲德菌素A（BFA）
  20μl来自步骤10a的稀释的GolgiStop混合物 4,960μl含DNase的完整培养基
3. 使用单通道移液器板50μl主混合物到每个孔。使用多通道移液器混合好。
在37℃，5％CO 2下再孵育5小时
转移细胞到96孔V底板。在4℃下以330×g离心板5分钟，除去上清液。将上清液倒入容器中弃去。要轻拂，把盘子翻过来，给一个坚定的摇动
使用多通道移液管和离心机在330℃下在4℃下将细胞重悬于200μlFACS缓冲液中5分钟。
再次使用多通道移液器，每孔加入200μlFACS缓冲液洗涤板。在4℃下以330xg离心板离心5分钟。将上清液倒入容器中弃去。要在此时停止协议，请参阅步骤要继续，请跳至步骤16.
出于时间考虑，该协议现在可以在这里停止一夜。使用多通道移液器在200μlFACS缓冲液中重悬细胞，放在冰箱过夜，第二天染色。在第2天染色之前，在4℃下以330×g离心板离心5分钟。甩出上清液。将纸板上的纸巾。然后继续执行步骤16.

表面染色细胞。

组成在FACS缓冲液中稀释的表面抗体的主混合物以前已为您的流式细胞仪滴定。染色是在50μl体积中进行500,000个细胞

我们发现以下组合适用于我们的BD LSR-II。

抗原	荧光团	克隆	稀释
CD3	ECD	UCHT1	1:50
CD14	ECD	RMO52	1：400
CD19	APCCy7	SJ25C1	1：100
CD7	Alexa700	124-1D1	1:50
CD16	太平洋蓝	3G8	1：100
CD56	PECy7	NCAM16.2	1：100
IgG（100μg/mL）1:10
活/死标记	胺水反应性染料（AARD）		1：200
FACS缓冲区

建议使用荧光减1（FMOs）。这些可以使用完全相同的抗体混合物，但省略一个抗体。我们关注CD107a和IFNγ的FMO，尽管FMOs可以用于所有荧光团最初设置适当的门控细胞计数数据
确保在330 x离心板在4℃下孵育5分钟，并在加入前将上清液轻轻倒出表面污渍。使用a。等分50μl抗体混合物到每个孔中单通道移液器。通过使用a。上下吹吸混匀多通道移液器。使板在冰上孵育30分钟弄脏。

30分钟后，使用多通道移液管，在4℃下以515×g离心5分钟，向所有孔中加入150μlFACS缓冲液。为了提高细胞从这一步的回收率，使用更快的离心机速度
将上清液倒入容器中弃去，并将该板在纸巾上吸干
通过使用多通道移液器在冰上加入100μl每孔的2％多聚甲醛的PBS溶液20分钟来修复细胞。
在4℃离心机中旋转5分钟，915×g下旋转
将上清液倒入容器中，弃去并在纸巾上打印
使用BD FACS Permeabilizing溶液2使细胞透化。
1. Perm2作为10x解决方案提供。用细胞培养级稀释至1倍。
2. 每孔加入75μl的1x Perm2溶液，使用多通道移液器和吸移管上下重悬细胞沉淀。
3. 仅在室温下孵育平板10分钟。
  1. 较短的孵育会减少细胞内染色孵育超过10分钟将显着影响细胞完整性并导致样品损失。
使用多通道移液器向每个孔中加入125μlFACS缓冲液洗涤一次
在4℃离心机中将板以915×g离心5分钟。
将上清液倒入容器中弃去，并将该板在纸巾上吸干
细胞内染色细胞。
1. 用APC-偶联的抗-IFNγ抗体组成抗体主混合物稀释到FACS缓冲液中（不稀释到Perm2缓冲液中）。
2. 通过单通道等分50μl抗体混合物到每个孔吸管。使用多通道移液器通过上下吹吸混匀。使板在冰上孵育30分钟以染色。
使用多通道移液器向每个孔中加入150μlFACS缓冲液洗涤一次。在4℃离心机中将板以915×g离心5分钟。
将上清液倒入容器中弃去，并在纸巾上擦拭
要固定，使用多通道移液器加入50μl每孔的2％多聚甲醛用PBS稀释。细胞应在冰上固定至少10分钟，但样品可在4℃下储存长达2天，而荧光染色没有显着变化。固定剂在分析之前不需要洗去。
在BD LSR-II上运行细胞。
使用FlowJo单细胞分析软件分析数据。使用对照样品上的FMO设置IFNγ和CD107a表达的门，并应用于收集的所有其他样品。门控策略的一个例子显示仅在培养基（即没有刺激），K562靶细胞刺激和IL-12 + IL-18刺激后的IFNγ和CD107a表达的结果（图1）。

图1.鉴定NK细胞和刺激反应的代表性门控策略。NK细胞被鉴定为CD3，CD14和CD19阴性的活淋巴细胞，但表达CD7，CD56和CD16。 K562靶细胞刺激诱导CD107a和IFNγ二者的表达。 IL-12 + IL-18细胞因子刺激诱导来自NK细胞的强大的IFNγ应答，然而这些细胞因子不导致如通过CD107a表达测量的脱颗粒。

食谱

完整的媒体（每次新鲜）
RPMI
10％胎牛血清
2mM L-谷氨酰胺青霉素（100单位/ml）/链霉素（100μg/ml） DNase 0.01mg/ml
FACS缓冲液（保质期1个月）
磷酸盐缓冲盐水
0.5％牛血清白蛋白
2mM乙二胺四乙酸
多聚甲醛（PFA）配方
每次稀释的PFA都是新鲜的
在PBS中稀释16％储备PFA至最终浓度为2％

致谢

该协议已经由Milush等人的出版物（2009和2013）改编。这项研究得到卫生和人类服务部资助的NIH资助，批准号为5T32HL007185给JMM。

参考文献

Milush，J.M.，Lopez-Verges，S.，York，V.A.，Deeks，S.G.，Martin，J.N.，Hecht，F.M.，Lanier，L.L.and Nixon，D.F。 CD56negCD16（+）NK细胞在HIV-1感染期间被活化的具有受损的效应子功能的成熟NK细胞。 Retrovirology 10：158
Milush，J.M.，Long，B.R.，Snyder-Cappione，J.E.，Cappione，A.J.，3rd，York，V.A.，Ndhlovu，L.C.，Lanier，L.L.，Michaelsson，J.and Nixon，D.F。通过共表达CD56，CD7而鉴定的人NK细胞和单核细胞/DC样细胞的功能不同的亚群，和CD4。血液 114（23）：4823-4831。