材料和试剂

细胞处理和流式细胞术
1. 1x Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，目录号：21-031-CV）
2. RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-093）
3. GemCell美国来源的胎牛血清（FBS）（Gemini Bio Products，目录号：100-500）
4. 37％甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F8775-500ML）
5. 叠氮化钠试剂（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002-25G）
6. 抗体
  1. CD3-APC（BD，目录号：340440）
  2. CD4-FITC（BD，目录号：347413）
  3. CD45-PerCP-Cy5.5（BD，目录号：340953）
7. AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：80204）
8. 染色流式细胞仪缓冲液（染色缓冲液）（参见配方）
9. 1％甲醛（1％FA）缓冲液（见配方）
10. RLT加缓冲液+β-ME（参见Recipes）（包含在AllPrep DNA/RNA小试剂盒中）
11. 70％乙醇缓冲液（见配方）
12. 10 mM Tris洗脱缓冲液（见配方）
DNA/RNA共提取和DNA沉淀
1. RNase-free DNase set（QIAGEN，目录号：79254）
2. AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：80204）
3. 分子生物学级无菌纯化水（RNase，DNase，无蛋白酶）
4. 纯乙醇（200分子生物学级）（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
5. 3 M NaOAc（乙酸钠）（Affymetrix，目录号：75897）
6. UltraPure糖原（Life Technologies，目录号：10814010）（浓度：20μg/μl）
7. 2-巯基乙醇（β-ME）（Life Technologies，Gibco ，目录号：21985-023）
8. Tris盐酸盐（1M溶液pH 8.0分子生物学级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1758-500）
9. 无RNA酶的DNA酶组（见配方）
ddPCR
1. Ban-II限制酶（New England Biolabs，目录号：R0119L）
2. 引物和探针（表1，IDT。）（最终PCR浓度：900nM引物，250nM探针）
3. iScript高级cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：172-5038）
4. 用于探针的ddPCR supermix（无dUTP）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1863024）
5. 液滴发生器筒和垫圈（Bio-Rad Laboratories，目录号：1864007）
6. 液滴发生器油（Bio-Rad Laboratories，目录号：1863005）
7. 液滴读数器油（Bio-Rad Laboratories，目录号：1863004）
8. 2x缓冲液对照（Bio-Rad Laboratories，目录号：1863052）
9. 可刺穿箔热封（Bio-Rad Laboratories，目录号：1814040）
10. 多通道试剂槽
11. 分子生物学级无菌纯化水（RNase，DNase，无蛋白酶）

设备

细胞处理和流式细胞术
1. 96孔板V-底（VWR International，目录号：12-565-460）
2. 37℃水浴
3. BD Accuri（使用板式装载机）（BD，目录号：653118）或等效的流式细胞仪
4. Sorvall RC4通用型模型离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75004481）或等效物
DNA/RNA共提取和DNA沉淀
1. 收集管（2ml）（QIAGEN，目录号：19201）
2. 具有可拆卸BD 23G 1/2 PrecisionGlide TM sup /针（BD，目录号：309589）的BD 3ml Leur-Lok ^TM注射器
3. BD 20G1½PrecisionGlide ^TM针（BD，目录号：305176）
4. 无菌1.5 ml微量离心机Eppendorf管
5. 无菌1.5 ml带螺帽的微管
6. 巴斯德吸管（移液管）
7. 涡流
8. 加热块
9. 台式离心机
10. NanoDrop 2000分光光度计
ddPCR
1. 96孔PCR干净板
2. 带状帽
3. 板密封胶膜
4. 96孔半裙板PCR板（Eppendorf，目录号：951020362）
5. 低保留量移液器吸头（200μl和20μl）
6. 1.5 ml螺旋管
7. Biorad液滴发生器和读取器，QX200液滴数字PCR系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：186-4001）
8. PX1 PCR板密封器（Bio-Rad Laboratories，目录号：181-4000）
9. 热循环仪
10. 用于ddPCR液滴转移的特殊多通道移液器（P-50）（例如 Rainin，目录号：L8-50XLS +）
11. 离心机旋转板
12. 分光光度法（Nanodrop）

过程摘要

程序

RNA和DNA共提取（Qiagen's AllPrep DNA/RNA mini kit）
1. 对于每个待提取的样品，准备一个1.5ml螺旋盖管，并加入300μl的1×DPBS。
2. 如果要进行流式细胞术染色，准备一个V型底96 并向每个样品中加入150μl含有20％FBS的RPMI 好。
  注意：为了标准化数据，CD4 ⁺ CD3 ⁺ T细胞的百分比将对每个样品进行评估。如果这些数据已经可用，请跳过步骤A2和A4。
3. 快速解冻500万外周血单核细胞（PBMC）在37℃水浴中等分，并转移至 1.5 ml螺旋盖管从步骤1.通过吸移混合几次。如果不需要流式细胞仪染色，直接进入步骤A5 注意：
  1. 在整个过程中将样品保存在冰上，因为细胞相关的RNA非常不稳定。
  2. 强烈建议当时不要解冻超过两个样品; 在8,000×g纺丝前的过程不能超过2分钟以使细胞死亡和细胞相关RNA的损失最小化
4. 流染色：
  1. 通过上下吹吸混合样品，将50μl（约200,000个细胞）转移到步骤A2制备的96孔板中。
  2. 在室温下立即以500×g离心96孔板3分钟。
  3. 小心地除去上清液，不用多通道移液器破坏细胞沉淀。
  4. 用200μl含20％FBS的RPMI洗涤; 然后在室温下以500×g离心3分钟
  5. 小心地移除上清液，不使用多通道移液管破坏细胞沉淀，并重悬于25μl染色缓冲液中
  6. 允许细胞休息15分钟室温。同时，进行RNA/DNA共提取
  7. 预混合1μlCD3-APC，1μlCD4-FITC，1μlCD45-PerCP-Cy5.5 抗体每个样品在1.5ml螺旋盖管中，足以运行所有的样品。
  8. 向每个样品孔中加入3μl抗体混合物
  9. 在室温下在黑暗中孵育15分钟
  10. 加入175μl染色缓冲液以洗涤细胞
  11. 在室温下以500×g离心3分钟
  12. 删除上清与多通道和修复与200微升的细胞 1％FA。通过吹吸上下混合，孵育至少10分钟以修复细胞。
  13. 在Accuri流中获取染色的样品细胞仪。如果染色的样品不立即获得，存储他们在4°C直到获得。应通过门控进行分析活的PBMC基于正向散射谱，随后是CD45 ⁺用于白细胞识别。 CD4 T细胞被鉴定为双倍的 CD3和CD4阳性（CD3 + sup + CD4 + sup）。
5. 在4℃下以8000xg离心1.5ml试管2分钟。
6. 完全去除上清液（用无菌细尖移液管），不会中断沉淀
7. 加入350微升RLT加缓冲液+β-ME，充分混合均匀细胞（涡旋20秒）
8. 将匀浆的裂解物转移到All Prep DNA旋转柱（柱与紫色环），并在> 10,000×g（最大值）离心1分钟速度）。
9. 将流过物转移到粉红色的柱上进行RNA纯化（步骤A11-17）
10. 将AllPrep DNA柱置于干净的2ml收集管中并储存在4℃（或室温短时间）用于DNA纯化（步骤 A18-25）。
  注意：不要冻结All Prep DNA离心柱。
RNA纯化
1. 按照制造商的方案提取RNA。包括DNAse步骤以避免任何DNA污染。
2. 为了增加RNA产量，在加热块中在60℃加热洗脱H 2 O（由Allprep试剂盒提供）。
3. 对于RNA洗脱，向柱中加入35μl预热的H 2 O，并在室温下温育10分钟。
4. 使用步骤13的洗脱液在室温下重复洗脱
5. 10,000离心1分钟。
6. 通过分光光度法（Nanodrop）测量RNA浓度
7. 立即进行下面讨论的cDNA生成或储存RNA在-80℃。
DNA纯化
1. 按照制造商的方案提取DNA。增加DNA 产量，进行两次连续洗脱（300μl+100μl），加热10 mM Tris-HCl或EB缓冲液（由Allprep试剂盒提供）在60℃温育。
2. 对于洗脱，加入300μl加热的10mM Tris-HCl或EB缓冲液
3. 在室温下孵育10分钟。
4. 在Eppendorf管（由Allprep试剂盒提供）中在室温下以10,000×g离心1分钟。
5. 将洗脱液转移到1.5 ml螺旋盖管中
6. 加入100μl10mM Tris-HCl或EB缓冲液（第二次洗脱）
7. 在Eppendorf管中以10,000×g离心1分钟。
8. 在步骤A21中将洗脱液转移到管中，最终体积为400μl洗脱。
DNA沉淀
1. 按以下顺序添加到提取的DNA中：
  1. 1/10体积的3M NaOAc（乙酸钠）
  2. 1μl糖原。
  3. 2体积的100％乙醇。
2. 通过倒置几次轻轻混合。 DNA"云/goop"应该可见。将沉淀的DNA样品在-20℃下保存过夜注意：如果DNA浓度预计非常低，可以储存在-80℃较短的温育（至少2小时）或过夜。
3. 冷孵育后，在4℃以> 10,000×g（最大速度）离心30分钟。
  注意：标记管的方向（北侧）以指示DNA在哪里沉淀。
4. 用无菌细尖移液管小心弃去上清液，不要影响DNA沉淀
5. 用1ml 70％乙醇（新鲜制备）洗涤DNA沉淀。轻轻混匀。
6. 在4℃下以> 10,000×g（最大速度）离心30分钟。
7. 使用细尖移液管完全去除上清液。做一个快速旋转。用微量移液管和无菌尖端，清除任何残留物液体而不破坏颗粒
8. 让管空气干燥2分钟或直到干燥。
  注意：不要过度干燥颗粒。
9. 将DNA沉淀重悬于30μl10mM Tris-HCl或EB缓冲液（由AllPrep试剂盒提供）中。
10. 通过分光光度法（Nanodrop）测量DNA浓度
11. 储存在4°C（或长期储存-20°C）。

通过ddPCR定量HIV DNA [总和2-LTR环（长末端重复）]和人类疱疹病毒
我们建议运行在多重CMV和EBV DNA，总和2 LTR圈HIV DNA（pol或gag）。由于它们是罕见事件，我们建议将它们一式三份运行。另外，我们使用RPP30（RNAse P）引物/探针组用于宿主基因组DNA定量（细胞标准化），其可以一式两份进行。
以下方案描述了单个PCR反应所需的试剂：扩大到重复数×1.5，以考虑由于移液造成的样品损失。例如，如果运行三次，准备DNA和试剂的4.5反应。

通过限制性消化准备DNA样本

每个PCR反应物应含有≤200的DNA最终浓度 ng /μl，总体积为5μl/孔（最大1,000ng /孔）。稀如果需要，用10mM Tris-HCl进行样品注意：
1. 如果更多样品需要测试，增加每孔反应次数成比例地用于限制性消化并随后分成重复 PCR。
2. 每个PCR反应不要使用超过1,000 ng的DNA，因为PCR反应受到很大影响。

在冰上准备与以下组分的消化混合物。 1次消化反应的量：

消化	浓度	1x
10x CutSmart缓冲区	1x	0.7
BanII限制酶	10x U /μl	0.6
分子级水		0.6
小计		1.9	μl混合/孔
DNA样本	200x ng /μl	5	μl
总计		6.9	总体积/孔

加入适当体积的消化混合物（每个PCR反应1.9μl）到每个含有DNA样品的孔中。盖好含有样品的孔带有条带帽
在热循环仪或水浴中在37℃孵育1小时
在200×g离心96孔板1分钟收集任何样品可能已经冷凝到孔的盖或侧面上。
将板直接放置在冰上，同时准备随后的步骤。

总量和2-LTR环状HIV DNA，CMV和EBV DNA和RPP30的定量

为了定量RPP30，DNA样品需要稀释1:10以达到工作范围 - 100ng的DNA是理想的。为此：
1. 在96孔板中，每份样品等分18μl不含核酸酶的分子级水
2. 将2μl消化的DNA转移到合适的孔中。
3. 盖上板并短暂涡旋混合。
4. 在200×g离心1分钟并置于冰上，同时制备随后的步骤。

在冰上制备含有以下组分的PCR混合物。 1个PCR反应的数量：

1x

RPP30	1x
2x ddPCR superMix for探针	10
20x RPP30 HEX引物/探针混合物	1
Rnase/DNase游离水	2.1
总计	13.1微升

Gag或Pol和2-LTR复用
2x ddPCR superMix for探针	10
20x Gag或Pol HEX引物/探针混合	1
20x 2-LTR FAM引物/探针混合物	1
RNase/DNase游离水	1.1
总计	13.1微升

CMV和EBV多路复用	1x
2x ddPCR superMix for探针	10
20x EBV HEX引物/探针混合物	1
20x CMV FAM引物/探针混合物	1
RNase/DNase游离水	1.1
总计	13.1微升

在冰上制备96孔PCR干净板。
注意：当设计PCR板布局时，最好分组测定反应以8组垂直，任何重复水平地横过板。这优化了时间和使用耗材。
对于每个PCR反应，加入13.1μlPCR混合物至6.9μl 非稀释的DNA样品靶DNA并稀释1:10的RRP30 DNA 定量。保持重复在同一个井，因为他们会在液滴生成阶段被分成用于PCR的单独的孔
对于后续的液滴生成阶段，需要8个样品在任何时间加载。如果没有足够的样品来确保这个，准备适当数量的含有20μl1x的孔缓冲液控制溶液。
使用粘性膜密封板，轻轻涡旋以确保样品和测定混合物充分混合。
在室温下以200×g离心1分钟以收集任何物质可能已经粘附到孔的顶部或侧面的样品。
继续如下所述的液滴生成。

点滴生成
注意：对于本节，使用低保留移液器吸头以减少由于样品或测定混合物粘在塑料吸头上造成的移液器错误。

打开PCR板封口机，使其达到适当的温度（180°C）。
将700 ml（1个容器）的发动机油倒入多通道试剂槽中
将墨盒装入墨滴产生器适配器。
从PCR板上除去粘性膜。使用低保留提示，转移 20微升PCR反应到中间孔的筒。使用P-20 多通道用于此过程。
注意：需要加载8个样本在任何一个时间。如果有任何空井，墨盒不能正确加压，液滴不会形成。
转移70微升发动机油到筒底部的井。使用P-200多通道进行此过程。顶井是空的和将接收生成的液滴
钩子发电机垫圈在发电机适配器和中心，装入液滴发生器单元并运行
当液滴生成完成时，从单元和丢弃橡胶垫圈。盒的顶部孔现在将包含液滴，中孔和下孔几乎空了
慢慢执行下一步并仔细地作为液滴是脆弱的，如果做了也会剪切很快。避免在最大速度下按压和释放柱塞用移液管吸头平稳地吸取或吸取溶液以确保完整性的液滴。将P-50多通道移液器设置为40μl，并连接低保留提示; P-50上的柱塞动作足够大缓慢移液动作以减少液滴的剪切。有了支架平，位置多通道在〜80°角度，使吸管尖靠在盒的底部。慢慢抽40微升的水滴从出口井
你应该看到一个乳白色的移液器提示; 这些是形成的液滴。慢慢吸取液滴到一列的96孔半裙板PCR板。不要回到墨盒和重新吸取潜在的剩余液滴; 这些液滴会变成剪切并影响下游分析
根据需要重复步骤18-24填充96孔板。
放一块密封箔，胶面朝下，在板的顶部。用预热的PCR板密封器在180℃下密封板。

PCR

使用能够设置50％斜坡速度的热循环仪（2-3 ℃/秒），并具有加热盖。液滴的化学性质要求更低加速速度以适当地达到PCR反应的温度
运行以下热循环程序：

gDNA - Gag或Pol和2LTR多重和RPP30

95°C
10分钟

94°C
30秒
50个周期

60°C
60秒

98°C
10分钟

4°C
∞

gDNA - CMV和EBV

95°C
10分钟

94°C
30秒
50个周期

54°C
60秒

98°C
10分钟

4°C
∞
程序完成后，将含有液滴的板在4°C保存不超过24小时或立即在Bio-Rad液滴读取器中读取。

分析
每个样品的模板拷贝通过对所有可获得的重复孔平均来计算。通过将估计的RPP30拷贝数减半来测量总细胞输入。可以将gag（或pol）或2-LTR的拷贝数标准化为通过RPP30（总细胞计数）确定的一百万个PBMC或一百万个CD4T细胞（通过流式细胞术测量的CD4T细胞的百分比确定并乘以总细胞计数）。 CMV和EBV可以归一化为通过RPP30（总细胞计数）确定的一百万个PBMC

通过ddPCR定量细胞相关的HIV RNA（未剪接和多重剪接）
我们建议以多重格式运行未剪接（gag）和多重剪接（Tat-Rev）RNA。聚腺苷酸，其量化完全伸长和正确处理的艾滋病毒1 mRNA，应单独运行，而不是多路复用。所有RNA样品均可运行一式两份。
下面的方案描述了单个PCR反应所需的试剂：扩大至重复数×1.5，以考虑由于移液造成的样品损失。例如，如果运行重复，准备3个反应。

通过逆转录准备RNA样本

确定RNA的浓度（从部分的步骤A17获得 A）在通过分光光度法（Nanodrop）测试的样品内。
RNA在冰上制备96孔PCR干净板。向其中，每PCR反应等分15μlRNA
使用以下准备逆转录（RT）混合物组件在冰上从iScript高级cDNA合成试剂盒。列出了1个反应的数量。

RT步骤
1x

20x iScript高级逆转录酶
1

5x iScript高级反应混合物
4
μl混合/孔

小计
5

RNA
15
微博

总计
20
总μl/孔
向每个含有RNA样品的孔中加入适当体积的RT混合物（每个PCR反应5μl）
用带帽盖住含有样品的孔。

向每个含有RNA样品的孔中加入适当体积的RT混合物（每个PCR反应5μl）
用带帽盖住含有样品的孔。

Centrifuge the 96-well plate at 200 x g for 1 min at 4 °C to collect any sample that might have condensed onto the cap or sides of the wells.
Place the plate place directly on ice.
Dilute samples that contain >200 ng/µl cDNA (calculated as 2x the initial concentration of RNA, assuming 100% efficiency of RT reaction) using nuclease-free molecular-grade water.

Quantitation of HIV RNA (gag and Tat-rev)

使用以下组分制备PCR混合物（数量表示为1 反应; 放大，准备混合为1.1x的总数反应）：

Gag-Tat/Rev Multiple	1x
2x ddPCR superMix用于探针	10
20x Gag HEX	1
20x Tat/Rev FAM	1	10
20x Gag HEX	1
20x Tat/Rev FAM	1 ...
Poly-A	1x
2x ddPCR superMix for probes	10
20x Poly-A FAM	1
RNase/DNase free water	1
总计	12

在冰上制备96孔PCR干净板。
注意：当设计PCR板布局时，最好将测定反应分组每组8个垂直，任何重复横向水平横跨板。这可以优化耗材的使用时间和使用。
对于每个PCR反应，将12μlPCR混合物加入到PCR板的每个孔中的8μlcDNA样品中。将复制物保持在同一孔中，因为它们将在液滴生成阶段分成用于PCR的单独孔
对于后续的液滴生成阶段，需要8个样品在任何时间加载。如果没有足够的样品来确保这个，准备适当数量的含有20μl1x的孔缓冲液控制溶液
使用粘性膜密封板，轻轻涡旋以确保样品和测定混合物充分混合。
在室温下以200×g离心1分钟以收集任何物质可能已经粘附到孔的顶部或侧面的样品。
继续如上所述的液滴生成（来自部分B的步骤15-26）。

PCR

产生液滴后，使用具有设置a的能力的热循环仪 50％斜升速度（2-3℃/秒），并具有加热盖。化学液滴需要较低的斜升速度以适当地达到温度用于PCR反应
运行以下热循环程序：

cDNA

95°C
10分钟

94°C
30秒
60周期60个周期

58°C
60秒

98°C
10分钟

4°C
∞
程序完成后，将含有液滴的板在4°C保存不超过24小时或立即阅读Bio-Rad Droplet Reader。

分析
Bio-Rad软件计算所有样品的浓度（copies /μl）。

对于HIV DNA，我们将数据标准化为百万PBMC或CD4：
首先，我们使用RPP30结果计算每孔的PBMC数：

然后，对于每个转录本，我们计算每百万PBMC的拷贝

我们也可以归一化到100万个CD4 T细胞：

在等式（2）中，每个百分比指的是阳性的分数该标记在先前细胞群体内。因此％CD45 ⁺是在所有PBMC内的百分比，％CD3 + sup是所有CD45 +细胞内的分数，并在CD3 +细胞中测量％CD4。如果细胞为这些染色三个标记，百分比可以通过顺序门控获得 CD45→CD3→CD4。
请注意，对于临床样品，％CD45 ⁺ 经常不可用。允许CD4细胞的精确标准化数量，三色流式细胞术应直接进行。
对于HIV RNA
RNA的标准化是有争议的。由于RNA表达可能不同跨细胞类型，疾病阶段，ART状态，活化状态和其他临床变量，使用管家基因不是常规推荐临床样品中的RNA正常化。在这里，我们提出两种替代方法的归一化细胞HIV RNA，使用RNA输入或使用多个输入细胞（as 通过细胞计数或通过RPP30在DNA级分中测量）。
首先，我们需要计算每个孔的总拷贝：

数据可以归一化为：
1. 总RNA
  首先，我们需要计算添加到反应中的cDNA的量：
  
  然后，我们标准化为100 ng的RNA
2. 百万PBMC
  首先，我们需要计算以前的等分试样中有多少个PBMC 萃取。我们将使用来自DNA测定的RPP30来定量细胞数字：
  
  对于每个评估的靶RNA：然后，我们归一化到数百万个PBMC：
  
  然后，我们规范到数百万个PBMC：
  
  我们还可以规范到数百万CD4 T细胞：
  
  上面的所有计算使用的输出以copies /μl为单位 Bio-Rad阅读器软件。如果需要置信区间，则相同可以对Bio-Rad计算的值重复计算软件的上限和下限置信限以拷贝/μl计。这个方法通常提供良好的估计，因为cDNA拷贝数测量通常是所有的不确定性的最大来源这些计算中使用的数量。
  
  HIV DNA和RNA的计算器模板（附加）

代表数据

图1. HIV，CMV和EBV的DNA测定。从HIV感染的ART抑制的样品的PBMC提取的DNA在ddPCR中运行。使用以下的Bio-Rad软件的ddPCR点图分析的实施例：A.多肽中的HIV gag-HEX和2-LTR-FAM，以1/10稀释并单独运行的RPP30-HEX，和（C）和CMV-FAM和EBV-HEX。

图2.细胞相关的HIV RNA。从HIV感染的ART抑制样品的PBMC中提取的RNA在ddPCR中运行。使用Bio-Rad软件的ddPCR点图分析的实例：（A）多重中的HIV gag-HEX和Tat-Rec-FAM和单独的（B）Poly-A-FAM。

视频1.如何为ddPCR生成液滴

笔记

HIV DNA限制酶：如果其他引物和探针组用于HIV DNA，必须检查消化酶以避免新扩增子中的任何切割。内切核酸酶的切割可以相对于NEBcutter工具（http://tools.neb.com/NEBcutter）交叉参考。

表1. ddPCR的引物和探针集

病毒	标本	参考	记者/猝灭剂染料	底漆前进	底漆反转	探头
HIV	RPP30		HEX/ZEN/IBFQ	GATTTGGACCTGCGAGCG	GCGGCTGTCTCCACAAGT	CTGACCTGAAGGCTCT
	Gag	[2]	HEX/ZEN/IBFQ	AGTTGGAGGACATCAAGC AGCCATGCAAAT	TGCTATGTCAGTTCCCCTT GGTTCTCT	AGACCATCAATGAGGAA GCTGCAGAATGGGAT
	Pol	[3]	HEX/ZEN/IBFQ	TACAGTGCAGGGGAAAGA ATA	CTGCCCCTTCACCTTTCC	TTTCGGGTTTATTACAGG GACAGCAG
	2-LTR	[4]	FAM/ZEN/IBFQ	AACTAGGGAACCCACTGC TTAAG	TCCACAGATCAAGGATAT CTTGTC	ACACTACTTGAAGCACTC AAGGCAAGCTTT
	msTat-Rev	[5]	FAM/ZEN/IBFQ	CTTAGGCATCTCCTATGG CAGGA	GGATCTGTCTCTGTCTCT CTCTCCACC	AGGGGACCCGACAGGCCC
	Poly-A	[6]	FAM/ZEN/IBFQ	CAGATGCTGCATATAAGC AGCTG	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTGAAGCA	CCTGTACTGGGTCTCTCTGG
CMV	CMV	[7]	FAM/ZEN/IBFQ	AGGTCTTCAAGGAACTC AGCAAGA	CGGCAATCGGTTTGTTGTAAA AACCCGTCAGCCATTCTCTCGGC
EBV	EBV	[7]	HEX/ZEN/IBFQ	CGGAAGCCCTCTGGAC TTC	CCCTGTTTATCCGATGGAATG	TGTACACGCACGAGAAATGCGCC

食谱

CGGAAGCCCTCTGGAC
TTC
CCCTGTTTATCCGATGGAATG
TGTACACGCACGAGAAATGCGCC

食谱

...

10 mM Tris elution buffer
Dilute 1 M Tris to 10 mM Tris using molecular grade water

QIAGEN’s RNase-free DNase
Prepare according to manufacturer’s protocol prior to co-extraction
Use a syringe with detachable 20G needle. Pre-make aliquots enough to cover the number of reactions to-be-run and stored at -20 °C

Acknowledgements

This work was supported by the Department of Veterans Affairs, the UCSD Center for AIDS Research (P30 AI36214), the CARE Collaboratory (U19 AI096113) and the James B. Pendleton Charitable Trust. This protocol was adapted from previous work (Gianella et al., 2014, Strain et al., 2013).

References

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