材料和试剂

自身反应性CD1限制性T细胞克隆（如de Lalla等人 2011中所述产生）
THP-1细胞（ATCC TIB-202 TM或其它靶细胞，其能够以CD1依赖性方式和在不存在外源提供的抗原的情况下刺激T细胞克隆）
表达相关CD1同种型和本身刺激性自身反应性T细胞的抗原呈递细胞（APC）
RPMI 1640（Amimed，目录号：1-41F01-I）
稳定的谷氨酰胺（Amimed，目录号：5-10K50-H）
丙酮酸钠（Amimed，目录号：5-60F00-H）
非必需氨基酸（Amimed，目录号：5-13K00-H）
卡那霉素（Amimed，目录号：4-08F00-H）
胎牛血清（Lonza，目录号：DE14-802F）
PBS（不含Ca 2+和Mg 2+）（Amimed，目录号：3-05F29-I）。
ELISA
1. MAb对：纯化的抗人GM-CSF（BioLegend，目录号： 502202），生物素偶联的抗人GM-CSF（BioLegend，目录号： 502304）; 纯化的抗人IFN-γ（BioLegend，目录号：50750），生物素结合的抗-IFN-γ（BioLegend，目录号：502504）
2. HRP-链霉亲和素（BioLegend，目录号：405210）
3. OPD SIGMAFAST（Sigma-Aldrich，目录号：P9187-50SET）
4. 细胞因子标准：重组人GM-CSF（BioLegend，编号：572409），重组人IFN-γ（BioLegend，目录号： 570209）
抗CD1阻断抗体（抗CD1c mAb）（Abcam，目录号：ab18216-100）
抗人CD19mAbs（Miltenyi Biotec，目录号：130-097-055）
甲醇（Applichem，目录号：A0688,2500PE）
氯仿（Applichem，目录号：A1585,1000）
乙酸乙酯（Merck KGaA，目录号：1.00868.1000）
1-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：34867）
二异丙醚（Sigma-Aldrich，目录号：3827-IL-F）
异丙醇（Applichem，目录号：A1592.2500）
乙酸（Applichem，目录号：A2354.0500）
丙酮（Applichem，目录号：A1567.2500）
乙腈（Riedel-De Haen，目录号：34967）
己烷（Sigma-Aldrich，目录号：34994）
HCl 37％发烟（Merck KGaA，目录号：317.1000）
甲酸（Merck KGaA，目录号：1.11670.1000）
乙酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542）
H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：95304）
水饱和的丁醇（见配方）
氨基盒上脂质分馏的洗脱溶液（参见配方）
完整介质（见配方）

设备

氨基丙基柱（SEP-PAK Vac 6cc，500mg NH 2柱）（Waters Corporation，目录号：WAT200606）
HPLC系统（Jasco）
Nucleosur C18 Pyramid end-capped column（3-μmparticle size，3-mm ID，125-mm length）（Macherey-Nagel，目录号：N9040986）
自动馏分收集器（Gilson，目录号：FC203B）
玻璃锥形管（30ml和1ml体积，Glass Keller）
玻璃移液管（Pirex）
96孔平底培养板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353075）
96孔ELISA免疫板（Maxisorp，Nunc，目录号：439454）
加湿的CO 2细胞培养箱（Heraeus，Hera cell 150）
分光光度计/ELISA读数器（Synergy H1 Hybrid Reader，BioTek Instruments）
超声波仪（Sonics，Vibra Cell）
旋转轮（Labinco BV，目录号：76000）
压力计调节的N 2气罐（Carba气体）

程序

脂质提取和分馏
以下脂质提取和分级分离程序改编自（Facciotti等人，2012; Folch等人，1957），并且其针对10μM，/sup>细胞。对于不同数量的单元格，请相应地调整卷。该方案用于从小鼠胸腺细胞或THP-1细胞（ATCC TIB-202 TM）提取脂质。对于其他类型的单元格，协议可能需要优化
脂质提取
1. 通过在室温下在300×下离心5分钟来沉淀细胞 g，将它们重悬于10ml PBS中并将其转移到玻璃管中此步骤后，仅使用玻璃管。
2. 通过离心（300×g /分钟）5分钟用10ml PBS洗涤细胞2次并用玻璃巴斯德吸出完全除去PBS 吸管。
3. 将沉淀重悬在8ml水/甲醇/氯仿（1:1:2体积/体积/体积）的混合物中。
4. 超声2×30秒（5Hz）。
5. 在室温下在旋转轮中孵育3小时。
6. 在室温下以3,100×g离心5分钟。
7. 用玻璃吸管收集有机层（底层）避免污染水相（上层）并储存在-20℃
8. 向剩余的水相中加入4ml甲醇/氯仿（1:2体积/体积）
9. 涡旋2分钟，并在室温下旋转孵育1小时
10. 在3,100×g离心5分钟。
11. 收集有机（底部）层用玻璃吸管避免用水相（上层）污染并储存在-20℃ 直到使用。
12. 重复步骤A8-11一次。
13. 收集收集的有机相，在氮气流下干燥〜2小时作为气流（〜3巴）通过连接的巴斯德吸管输送到N 2源。溶于2ml甲醇/氯仿（1:2vol/vol）中储存于-20°C。我们将这种提取称为"非极性"，因为它包含除高度极性之外的大多数细胞脂质那些。
14. 测量剩余水相的体积，并加入1体积的水饱和的丁醇（见配方）
15. 涡旋2分钟，并在室温下在旋转轮中孵育1小时
16. 在3,100×g离心5分钟。
17. 收集上层（丁醇相），在氮气流下干燥，溶于2ml甲醇中，-20℃保存。作为这种提取含有难溶于甲醇/氯仿的高极性脂质称为"极性"。
脂质分馏
以下分馏程序允许使用氨基丙基筒分离10个不同极性的单独级分中的非极性和极性脂质提取物。应用这里描述的相同的程序两个脂质提取单独使用两个不同的墨盒。
1. 用6ml己烷平衡滤筒。
2. 用提取的脂质的总体积（2ml，图1A）装载筒
3. 依次使用指定体积的洗脱液（见食谱），并收集通过重力洗脱的级分玻璃锥形管（图1B;每个字母表示洗脱液和它也标识个别级分，例如洗脱的级分解决方案"a"被称为"a"，等。）：
  1. 4 ml
  2. 4 ml
  3. 3 ml
  4. 11 ml
  5. 9 ml
  6. 3 ml
  7. 4.5 ml
  8. 6毫升
  9. 4 ml
  10. 4ml
4. 在氮气流下干燥洗脱级分，并将每种级分溶解在如下所示的溶液和体积中：
  1. 280μl甲醇/氯仿（1:2vol/vol）
  2. 280μl甲醇/氯仿（1:1体积/体积）
  3. 280μl甲醇/氯仿（1:1体积/体积）
  4. 280μl甲醇/氯仿（1:1体积/体积）
  5. 280μl甲醇/氯仿（1:1体积/体积）
  6. 280μl甲醇/氯仿（9:1体积/体积）
  7. 280μl甲醇/氯仿（9:1体积/体积）
  8. 280μl甲醇/氯仿（9:1体积/体积）
  9. 280μl甲醇/氯仿（9:1体积/体积）
  10. 500μl甲醇/氯仿（9:1体积/体积）
5. 将每个重悬浮的馏分储存在-20℃
  
  图1.说明脂质分级程序的方案。 A. 将非极性和极性提取的脂质加载到两个单独的氨基（NH 2）墨盒。 B.从氨基序列洗脱脂质部分墨盒。字母表示洗脱液和相应的级分。数字表示洗脱和馏分收集的时间顺序。
T细胞活化测定
在本节中，我们描述如何评估脂质制剂的T细胞刺激能力。为了最大化测定灵敏度，必须考虑一系列基本点
1. 识别提取脂质的细胞的自身反应性T细胞克隆应当是高度响应的
2. APC应该表达高水平的限制性分子，以获得最佳的抗原呈递
3. 应选择APC的刺激能力差不存在外源添加的抗原，以便使水平最小化背景刺激的自身反应性T细胞缺失肿瘤衍生的脂质。
由于我们在实验中使用的T细胞克隆是CD1c限制性的，我们选择来自健康供体的新鲜纯化的循环B细胞作为APC。这些细胞在不存在添加的抗原的情况下显示高水平的细胞表面CD1c和弱刺激的T细胞克隆（De Libero等人，2005）。通过根据制造商方案使用偶联于抗人CD19mAb的磁性MicroBeads进行分选来实现B细胞的分离。在另一组实验中，我们使用用CD1c基因转染的低数量的固定THP-1细胞（10×10 6 /孔）（De Libero等人，2005）。我们观察到用0.05％戊二醛固定20秒显着降低THP-1-CD1c细胞的CD1c依赖性T细胞克隆刺激能力，从而使得在加入活性脂质级分后可能检测脂质特异性T细胞刺激。然而，固定APC的使用具有重要的限制。固定的细胞是代谢失活的，不能处理抗原。因此，如果未知的脂质抗原需要处理步骤，则使用固定的APC不会揭示含有未加工抗原的脂质级分的T细胞刺激活性。注意，根据个体实验设置和目标，需要在初步实验中优化所有上述问题（T细胞和APC的选择，APC的固定，等）。
1. 在45μl完全培养基中的96孔平底板中铺板1-5×10 5个APC /孔。
2. 准备每个脂质部分的至少3稀释。测试稀释度应在原料的1：10-1：1,000的范围内制备。当级分溶解在有机溶剂中时，对细胞有毒性（溶剂的体积和类型在段落"脂质分馏"的步骤B4），它们需要干燥（在氮气下，以避免氧诱导的脂质改变）并提供到溶液中的细胞，其与细胞活力相容。通常，将20μl的每个级分转移到新的玻璃中锥形管，干燥，溶于20μlPBS中20％甲醇（vol/vol，车辆）并超声处理。然后将溶解的级分用于脉冲APC 。
3. 添加分数到镀敷的APC。例如，5 μl的各溶解级分（未稀释或预先稀释1:10或 1：100，使用PBS 20％甲醇）加入到含有APC的孔中 45微升完全培养基。以这种方式，每个脂质部分将是在培养物中分别以1:10,1:100或1:1000稀释井。重要的是，包含在载体中的甲醇，级分溶解也将被稀释至终浓度 2％，其与APC存活力和T细胞活化相容。包括对照孔，其中只有载体（5μlPBS 20％甲醇）加入到45μl的APC中。执行一式三份的副本每个实验条件
4. 在37℃在潮湿CO 2培养箱中孵育4小时
5. 在50μl完全培养基中加入5×10 5个T细胞/孔
6. 在37℃在潮湿CO 2培养箱中孵育24-48小时。
7. 收集上清液并通过标准测量细胞因子释放夹心ELISA（根据制造方案;参见材料和试剂）。我们测量GM-CSF（24小时后）和IFN-γ的释放（48小时后）作为T细胞活化读出。但是，这是很重要的注意到细胞因子的选择需要根据通过测试的T细胞更多地释放细胞因子并排除那些由APC提供的，应该在初步确定实验。一般来说，GM-CSF释放代表非常敏感和相对快速地读出用于体外T细胞克隆激活。测量至少两种不同的细胞因子是可以避免假的阳性结果。如果脂质部分诱导，则认为它们是阳性的剂量依赖性T细胞细胞因子释放。结果表示为fold 改变背景（在APC存在下的细胞因子释放）与脂质/细胞因子释放与用载体孵育的APC孵育）。倍数变化≥2被认为相关。
8. 活动的刺激级分必须在第二组中被证实实验，其中特异性针对CD1同种型的阻断抗体其包括限制所使用的T细胞的应答。阻塞抗体和合适的同种型对照抗体用于a 最终浓度为20μg/ml，并加入到与之孵育的APC中活性脂质级分在T细胞之前至少30分钟。
活性脂质级分的亚分级分离一旦鉴定一个或多个T细胞刺激性脂质级分，进行第二分级分离步骤以进一步纯化抗原性脂质分子。
本节中描述的步骤使用用Nucleodur C18 Pyramid封端柱（3-μm粒径，3-mm ID）和两个流动相进行的反相HPLC：
流动相A：甲醇/水/甲酸（74:25:1，体积/体积/体积）（pH4.0）
流动相B：甲醇/甲酸（99:1，体积/体积）（pH4.0）使用以下梯度分离极性脂质：
1. B从时间0到min 1的20％
2. B从20％到50％从min 1到min 2
3. B 50％从min 2到min 4
4. B从50％至100％至最小4至最小34
5. B 100％从min 34到min 54
6. B从100％到20％从最小54到最小55
7. B 20％从min 55到min 60
流速为0.5ml/min
1. 将活性脂质级分注入HPLC系统中
2. 每30秒使用连接到HPLC系统的自动收集器收集单独的子级分
3. 在氮气流下干燥亚级分，并在10μl甲醇中重悬分级分离的脂质。
4. 如上所述通过在各种稀释度下测试所有单独的亚级分来进行T细胞活化测定。
5. 将其余的亚级分保存在-20°C用于进一步分析。
在鉴定T细胞刺激性脂质级分后，需要进行结构分析以表征活性脂质分子。液相色谱 - 串联质谱，高分辨率质谱和NMR 技术（De Libero等人，2005; Lepore等人，2014年）。

代表数据

图A.A.CD1限制性人T细胞克隆对从THP-1细胞提取的脂质级分（A-J）的应答。测试每个级分的三个稀释度。通过ELISA测量上清液中释放的GM-CSF，并表示为相对于背景的倍数变化。 B.对应于图A中T细胞刺激性脂质部分G的亚分级分离的HPLC图谱。每30秒收集次级分。 C.通过CD1限制性T细胞克隆将GM-CSF释放到级分G的HPLC亚级分中。以两个稀释度（1:10，填充柱和1:100，空心柱）测试每个亚级分。栏表示sd。

对于更具代表性的数据还参考以下：T细胞活化测定，图3（Lepore等人，2014）;脂质亚分级分离，图1（Facciotti等人，2012）和图2（Lepore等人，2014）。

食谱

水饱和的丁醇
1-丁醇/H 2 O 1：1，体积/体积剧烈摇动5分钟，静置至少30分钟以使相分离。使用饱和丁醇（上相）。
氨基管上的脂质分馏洗脱液
1. 乙酸乙酯/己烷15:85，体积/体积
2. 氯仿/甲醇23:1体积/体积
3. 二异丙醚/乙酸98:5，体积/体积
4. 丙酮/甲醇9:1.35，体积/体积
5. 氯仿/甲醇2:1，体积/体积
6. 甲醇
7. 异丙醇/3N HCl的甲醇溶液4:1，体积/体积
8. 甲醇/3N HCl的甲醇溶液9：1，体积/体积
9. 氯仿/甲醇2:1，体积/体积
10. 氯仿/甲醇/3.6M乙酸铵水溶液30/60/8，vol/vol/vol
完成媒介
RPMI 1640
2mM稳定的谷氨酰胺 1mM丙酮酸钠 1 mM非必需氨基酸
50μg/ml卡那霉素 10％热灭活的胎牛血清

致谢

这项工作是由瑞士国家科学基金会（NMS1813），A * STAR /澳大利亚NHMRC（1201826277）和巴塞尔大学（DMS2306）的拨款支持。这里描述的方案用于（Facciotti等人，2012）和（Lepore等人，2014）。

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