材料和试剂

种子（在田间收集，在意大利的西北地中海草甸;来自该兰花种子的种子可以通过国际植物园的索引seminum 检索或种质库）
接种物（菌株MUT 4182）（预先在MEA培养基上的无菌培养物中生长）
无菌双去离子水（中性pH）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
碾碎的燕麦（从有机商店检索）
麦芽提取物（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：70167）
乙醇（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：02860）
5％次氯酸钠（商业漂白剂）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
蛋白胨（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：P5905）
灭菌溶液（参见配方）
固体燕麦培养基（见配方）
MEA介质（参见配方）

设备

余额
小铲
小金属钳
无菌10 x 10毫米Whatman 1号滤纸
柳叶刀
2.0 ml离心管
微量移液器
过滤提示
离心机
涡流
计时器
层流罩
培养皿（直径9cm）
石蜡膜（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
本生灶
气候室（Binder GmbH）

程序

用乙醇和酒精擦拭工作区域，用火焰对抹刀消毒
擦拭层流罩和酒精/火焰消毒镊子和柳叶刀。所有步骤必须在层流罩下进行
每个2.0ml离心管中加入约25mg的种子，仔细地将所有的种子放到离心管的底部。为此，将所有管以最大速度离心，其盖子打开1分钟。确保不要在盖边缘留下任何种子的残留; 这些种子将不会被灭菌并且可能污染那些灭菌的那些。
消毒种子，每个管加入1ml灭菌溶液，立即启动计时器;混匀，并置于涡旋18分钟。
之后，以最大速度离心1分钟，并用1ml无菌去离子水快速更换灭菌溶液。孵育5分钟，并重复该洗涤步骤三次。为了避免在更换洗涤水时在尖端中收集种子，简要离心以将所有种子收集到离心管的底部。
注意：步骤4和5必须在20分钟内完成。
使用无菌镊子，在填充有25ml如图1所示的固体燕麦培养基的培养皿上均匀分布4-00平方的Whatman No.1滤纸（10×10mm）。轻轻地将种子铺开滤纸方格使用吸管和过滤嘴。通常建议准备10至20个培养皿。
注意：每张滤纸都是重复的，上面指出的方格数量是单个培养皿中使用的最小值和最大值。
接种每个陪替氏培养皿用 Calsalella calospora （AL13/D菌株）。接种物由用来自真菌纯培养物的培养皿的无菌柳叶刀切割的活性生长的菌丝体（来自MEA培养基上的纯培养物）的3×3mm部分，使用无菌柳叶刀置于胶囊的中心（图1）。对照板未接种。
密封培养皿与石蜡膜和铝板（以确保黑暗），并放置在温度稳定在20℃的气候室（图2）。
当在15-30天后从吸收的种子形成原球茎时，种子相当可能萌发。在这段时间后，发达的原球茎，开始生长在带叶子的小植物。良好发育的苗可以暴露在光周期为16小时光照（20-25°C）和8小时黑暗（18-20°C）（图3）的光照下。

代表数据

图1.发芽测定的代表性方案[从Ercole（2014）修改]

图2.在15-30天黑暗孵化后开发的原生动物

图3. 45天（30天黑暗和15天曝光）后开发的原生动物

共生种子萌发的重复性。 vomeracea 与 T。 calospora 通常是成功的。在一些情况下，我们注意到由于种子活力主要的低发芽率。对种子的活力测试允许先验地评估成功率。发芽百分比可以通过在时间零点（所有种子播种）的所有种子和在15,30和45天的发芽种子的计数来评估。通常我们报告高发芽率（从15天时的95％到45天时的60％）。从时间15天到时间45天的萌发百分比的减少主要是由于"自然选择"和/或种子之间的竞争（具有高生长速率的种子以较慢的速度生长）。

笔记

注意，该协议可以应用于许多不同的兰花和真菌物种，在种子的灭菌时间的一些修改。每个兰花种有不同的种子，不同的种子，所以灭菌时间取决于此。在某些情况下，萌发的成功取决于兰花和真菌之间的相容性;实际上，不是所有的真菌（也在丝核菌属（Rhizoctonia）形式属中）可以发芽兰花种子。

食谱

灭菌溶液（1％次氯酸钠）（100ml）次氯酸钠5％（w/v）20ml
加入去离子水至100 ml终体积搅拌均匀混合
向溶液中加入100μlTween-20
固体燕麦培养基（0.3％研磨燕麦，1％琼脂）（1L）
碾米燕麦3克
琼脂10克
加入去离子水至1 L最终体积
高压灭菌20分钟
MEA培养基（1.8％麦芽提取物，2.0％琼脂，2.0％葡萄糖，0.2％蛋白胨）（1L）
麦芽提取物18克
琼脂20克
葡萄糖20克
蛋白胨2 g
加入去离子水至1 L最终体积
高压灭菌20分钟

致谢

该协议改编自以下出版物：Perotto等人（2014）; Ercole （2013）; Ercole（2014）。
兰花菌根的研究部分由意大利MIUR和来自都灵大学的地方资助。

参考文献

Ercole，E。（2014）。 Micorrize e conservazione delle orchidee。 In：Adamo，M.，Masella，EA，Bonini，I.，Borzatti，A.，Buono，S.，Carasso，V.，Castagnini，P.，Ceriani，RM，Chioccia，G.，Ciaschetti， Vitis，MD，Martino，DL，Ercole，E.，Fabrini，G.，Fay，MF，Fonck，M.，Gallino，B.，Gransinigh，E.，Haile，G.，Legitimo，I.，Maccherini，S 。，Magrini，S.，Mannocci，M.，Marks，TR，Mazzoncini，V.，Pellegrino，G.，Pierce，S.and Pirondini，A。 Esperienze di conservazione delle orchidee 。 Viterbo：Tipoligrafia Quatrini，vol。 1，p。 17-23。
Ercole，E.，Rodda，M.，Molinatti，M.，Voyron，S.，Perotto，S.and Girlanda，M。（2013）。冷冻保存兰花菌根真菌：保护濒危物种的工具 J Microbiol Methods 93（2）：134-137。
Girlanda，M.，Segreto，R.，Cafasso，D.，Liebel，H.T.，Rodda，M.，Ercole，E.，Cozzolino，S.，Gebauer，G.and Perotto，光合地中海草甸兰花具有部分肌营养不良和特异性菌根关系。 Bot 98（7）：1148-1163。
Perotto，S.，Rodda，M.，Benetti，A.，Sillo，F.，Ercole，E.，Rodda，M.，Girlanda，M.，Murat，C.and Balestrini，R。在菌根兰花原生动物中的基因表达提示了一种友好的植物真菌关系。 Planta 239（6）：1337-1349。