材料和试剂

DNA（25ng /μl）例如来自两周龄的大麦幼苗; 或根据每个特定生物的PCR实践
PCR试剂
1. 0.5U Taq DNA聚合酶（Solis Biodyne FIREPol ，目录号： 01-01-01000）或HotStart Taq 聚合酶（Solis Biodyne HOT FIREPol 目录号：01-02-01000; 任何其他供应商也应该令人满意）与相应的10×PCR缓冲液（用Taq DNA聚合酶提供）
2. 25mM MgCl 2（用Taq DNA聚合酶提供）
3. dNTP（各10μM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0182）
4. 使用通用M13尾（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'（脱盐的）（1μM））在5'末端尾标的正向特异性引物
5. 反向特异性引物（脱盐）（10μM）
6. 具有与M13尾（10μM）（Metabion，Planegg/Steinkirchen）互补序列的生物素化通用引物，
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
溴化乙锭（Roche Diagnostics，目录号：HP46.2）
焦磷酸测序试剂
1. 测序引物（脱盐）（10μM）
2. 链霉亲和素Sepharose HP（GE Healthcare，目录号：17-5113-01）
3. 退火缓冲液（QIAGEN，目录号：979009）（参见配方）
4. 结合缓冲液（QIAGEN，目录号：979006）（参见配方）
5. 变性溶液（QIAGEN，目录号：979007）（参见配方）
6. 洗涤缓冲液（QIAGEN，目录号：979008）（参见配方）
7. 高纯度水（Milli-Q）
8. 70％乙醇
9. PyroMark Gold Q96试剂（酶混合物，底物混合物和核苷酸）（QIAGEN，目录号：972807）
凝胶运行缓冲液（参见配方）
6x DNA上样缓冲液（见配方）

设备

热循环仪（Applied Biosystems）
水平电泳系统（Bio-Rad Laboratories）
PyroMark Q96仪器（QIAGEN，目录号：9001525）
PyroMark Q96板（QIAGEN，目录号：979002）
PyroMark Q96真空工作站（220 V）（QIAGEN，目录号：9001529）
真空泵（KNF实验室，Typ N816.1.2 KN.18）
微量滴定板的轨道振动器
加热块（80℃）
PyroMark Q96 Cartridge（QIAGEN，目录号：979004）
PCR 96孔板（Greiner Bio-One，目录号：652250）

软件

PyroMark Assay设计软件V.1.0.6。（QIAGEN）

程序

使用PSQ Assay设计软件设计正向，反向和测序引物
1. 在"序列编辑器"中输入或导入感兴趣的序列由IUPAC代码或以下格式表示的SNP位置： C/T。
2. 扩增子大小应在150至200bp之间。
3. 尾部引物（正向或反向）不应超过20bp
4. 测序引物应设计在靶SNP的1至5个核苷酸之间
5. 根据PCR和焦磷酸测序的质量，选择由软件分配的具有最高分数的引物
6. 将引物序列导出到excel文件并手动添加通用尾（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）到5'端正向或反向引物
7. 复制并粘贴到excel文件中 "序列分析"，这将需要以后在运行期间 PSQ 96仪器为了建立分配顺序不同的核苷酸。
在25μl的终体积中制备PCR混合物：1×PCR缓冲液，2.5mM MgCl 2，0.2mM dNTP，0.02μM尾部正向引物，0.2μM反向引物，0.18μM生物素化M13引物，0.5U的Taq聚合酶和50ng的DNA。即使考虑了其他DNA来源（例如，PCR产物），也应该使用至少50 ng。
运行以下PCR程序：94℃5分钟; 12个循环，94℃30秒，62℃30秒（初始12个循环的接触0.5℃/循环 - 剩余35个循环的56℃的最终退火），72℃30秒;和在72℃下10分钟的最终延伸步骤。在该步骤中，将生物素掺入PCR产物中，如Schuelke（2000）所述用于PCR片段的荧光标记。
运行3μl的PCR产物在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶（1.5％）。
检查单个和强大的DNA片段与预期大小的存在。如果存在任何非特异性产物，如果引物设计准确地进行则这是非常不寻常的，可以将HotStart Taq 聚合酶可以与上述相同的PCR混合物一起使用，除了MgCl 2（2mM），dNTP（0.125mM）和Taq（0.6U）。在这种情况下的PCR程序如下：在95℃下15分钟; 12个循环，95℃30秒，62℃30秒（初始12个循环的触底为0.5℃/循环 - 剩余45个循环的56℃的最终退火），72℃30秒; 和在72℃下10分钟的最终延伸步骤
在开始焦磷酸测序测定之前，让缓冲液达到室温
向PCR样品中加入高纯度水至终体积为40μl
制备链霉亲和素Sepharose珠（每个样品3μl）和结合缓冲液（每个样品37μl）的混合物。
将40μl步骤8中制备的混合物加入到PCR板的每个孔中
密封板，并摇动PCR板恒定在ca。在室温下以1,000rpm离心10分钟
在退火缓冲液中加入40μl0.4μM的测序引物到待使用的PSQ板的每个孔中
摇动后，将PCR板和PSQ板放在真空工作台上
用以下溶液填充真空工作站中的五个独立的槽中的每一个：110ml乙醇（70％），90ml变性溶液，110ml洗涤缓冲液，110ml高纯度水和180ml高纯度水。
将真空准备工具（VPT）放入水槽，打开真空泵（图1）。

图1.带真空准备工具（VPT）和不同槽的真空工作站
冲洗过滤器探头20秒。
将VPT移入PCR板以捕获含有固定化模板的珠子
将VPT顺序传输到包含以下内容的槽：
1. 70％乙醇5秒
2. 变性溶液5秒。
3. 洗涤缓冲液5秒。
将VPT以90°角升高5秒，以从过滤器探头中排出液体。
关闭真空泵并使VPT返回水平位置。
将VPT放在PSQ 96板中以释放珠。轻轻摇动VPT，让它在孔底部停留几秒钟。
将VPT移动到水槽，通过搅拌10秒来清洗过滤器。
将PSQ板在80℃下加热2分钟以使模板变性。在室温下冷却PSQ板至少5分钟，以允许测序引物退火
根据制造商的说明选择仪器参数，包括在步骤1g中获得的"分析顺序"。将估计量的PSQ试剂装入墨盒。
将板放在PSQ 96仪器中，小心插入墨盒。开始运行
在运行结束时，在图形显示（图2）中显示了热谱图，并且PSQ软件通过与基于"分析序列"的先前定义的理论模式相比较来为每个样品指派基因型。

图2.焦磷酸测序分析后获得的热解图，显示在T/C SNP 两种可能的基因型中的每一种

笔记

在该方案中仅测试了有尾引物。反向引物的尾巴应以相同的有效方式工作
如果在扩增后获得清晰且强的PCR产物，则25μl反应混合物可以减少至仅仅15μl，而对随后的焦磷酸测序分析没有任何负面影响。
检查各种引物化学计量（1:2,1:5,1:10;尾部正向引物：通用引物），以评估哪种浓度的通用引物产生最高量的生物素化PCR片段。基于尾部正向引物和通用引物的不同比率，在热裂解图中没有观察到差异。选择1:10比例，因为其允许降低标记引物的费用（Silvar等人，2011）。

食谱

退火缓冲区
20 mM Tris-乙酸盐 2mM Mg-醋酸盐 pH 7.6
绑定缓冲区
10mM Tris-HCl
2 M NaCl
1mM EDTA
0.1％Tween 20
pH 7.6
变性溶液
0.2 M NaOH
洗涤缓冲液
10mM Tris-乙酸盐 pH 7.6
凝胶运行缓冲液
1 Tris-Borate-EDTA
89 mM Tris碱
89mM硼酸 2mM EDTA（pH8.0）
6x DNA加载缓冲液
30％（v/v）甘油 0.25％（w/v）溴酚蓝
0.25％（w/v）二甲苯cyanol FF

致谢

该协议改编自Silvar等人（2011）。焦磷酸测序测定，包括退火平板制备，将PCR产物固定在链霉抗生物素珠上和制备单链焦磷酸测序模板DNA，基本上如制造商的说明书中所述进行。

参考文献

Schuelke，M。（2000）。荧光标记PCR片段的经济方法。 Nat Biotechnol 18（2）：233-234。
Silvar，C.，Perovic，D.，Casas，A.M.，Igartua，E。和Ordon，F。（2011）。在大麦中开发用于SNP基因分型的成本有效的焦磷酸测序方法。植物品种 130（3）：394-397