材料和试剂

DNA（25ng /μl）（例如来自两周龄大麦幼苗的;或根据每个特定生物的PCR实践）
PCR试剂
1. 将0.5U Taq FIREPol DNA聚合酶（Solis Biodyne FIREPol ，目录编号：01-01-01000; 任何其他供应商也应该满意）与相应的10x PCR缓冲液（与FIREPol DNA一起提供）聚合酶）
2. 25mM MgCl 2（与FIREPol DNA聚合酶一起提供）
3. dNTP（各10μM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0182）
4. 用通用M13在5'末端尾端特异性引物尾（1μM）（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）（脱盐）（Microsynth）
5. 反向特异性引物（10μM）（脱盐）（Microsynth）
6. 荧光（6-FAM，HEX，NED或Cy5，D2，D3）标记的引物互补序列与M13尾（10μM）（Metabion， Planegg/Steinkirchen）
限制分析
1. 限制性内切酶（New England Biolabs或Fermentas）
2. 1x缓冲液限制性内切酶（New England Biolabs或Fermentas）
1.5％琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
溴化乙锭（Roche Diagnostics，目录号：HP46.2）
DNA加样缓冲液3x [6x; 30％（v/v）甘油，0.25％（w/v）溴酚蓝，0.25％（w/v）
在ABI PRISM 3100遗传分析仪分离凝胶（Applied Biosystems，目录号：4363929）上的分析
1. ROTISOLV HPLC HPLC梯度级水（Roche Diagnostics，目录号：A511.3）
2. 作为样品上样缓冲液的HiDi TM TM甲酰胺（Applied Biosystems，目录号：4311320）
3. GeneScan ^TM ROX大小标准（Applied Biosystems，目录号：401734）
4. 96孔半裙板PCR板（Kisker，目录号：G060/H/1E/OA-SS）
对Beckman Coulter CEQ ^TM 8000遗传分析系统的分析
1. GenomeLab ^TM分离凝胶LPA I（Beckman Coulter，目录号：608010）
2. 96孔半裙，分段PCR板（Kisker，目录号：G060/H/1E-SG）
3. 分离缓冲板，未灭菌（Beckman Coulter，目录号：609844）
4. GenomeLab ^TM DNA Size Standard 600（Beckman Coulter，目录号：608095）
5. GenomeLab ^TM分离缓冲液（Beckman Coulter，目录号：608012）
6. 甲酰胺作为样品上样缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号： F9037）或原始样品上样缓冲液（SLS）（Beckman Coulter，目录编号：608082）
凝胶运行缓冲液（参见配方）

设备

热循环仪（Applied Biosystems）
水平电泳系统（Bio-Rad Laboratories，Sub-Cell Model 96 Cell）
ABI PRISM 3100遗传分析仪或Beckman Coulter CEQ ^TM 8000遗传分析系统
加热块，浴缸或烤箱进行限制分析
PCR 96孔板或管

软件

GeneMapper <4.0软件（Applied Biosystems）或GenomeLab GeXP Software（Beckman Coulter）

程序

准备PCR混合物，最终体积为15μl：1×PCR缓冲液，2.5mM MgCl 2，0.2mM dNTP，0.02μM的尾部正向引物，0.2μM的反向引物引物，0.18μM荧光标记的（6-FAM，HEX，NED或Cy5，D2， D3）M13引物，0.5U Taq聚合酶和50ng DNA
运行 PCR程序：94℃5分钟; 12个循环，94℃30秒，在62℃下30秒（最初12个循环的触底为0.5℃/循环 - 最后退火56℃，剩余35个循环），72℃30秒; 和a 最后延伸步骤在72℃下10分钟
检查3μl的PCR产物在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶（1.5％）中。
限制性测定。限制性位点的存在应该是之前通过比较目标样品的序列来评估。的可以进行合适的限制性内切核酸酶的搜索使用工具SNP2CAPS（ http://pgrc.ipk-gatersleben.de/snp2caps/）（Thiel等人，2004）或使用网络工具NEB刀具（ http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）。限制性分析的预测可以在每个片段上用相应的酶进行 TAIR网站（ http://www.arabidopsis.org/）。片段大于应舍弃600 bp。
1. 将12μl（剩余的PCR混合物）的PCR产物放入PCR管中
2. 加入1U相应的限制酶，连同特定缓冲液
3. 在加热块，浴或烘箱中在适当温度下孵育，根据酶供应商的说明书，3小时。
在ABI PRISM 3100遗传分析仪或Beckman Coulter CEQ ^TM 8000遗传分析系统上的片段分析。
一个。混合等量的每种限制产品（6-FAM，HEX，NED或 Cy5，D2，D3）。 M13尾产品应该是1/20 用HPLC梯度级水（ROTISOLV）稀释，体积为20μl μl。
b。通过混合HiDi-Formamide和Rox-Standard为每个样品制备主混合物 - 14μlHiDi和0.04μlRox-Standard。
C。在每个孔ABI或Beckman PCR板（P/N N8010560）和1μl稀释的PCR产物中加入14μl主干混合物。
d。在96℃下将DNA板变性5分钟，然后更换缓冲液/水在ABI PRISM分析仪或Beckman Coulter分析的罐中系统，放入设备。
数据分析与相应的软件（GeneMapper 4.0 Software或GenomeLab ^TM GeXP 软件）。只有那些保留荧光标记的片段（图1）。

图1.原理图说明毛细管电泳系统分析后的预期结果使用CAPS基于荧光的多重协议。 A.消化来自两个纯合品种（ a/a ）和 b/b 从相应的杂合F1代（ a/b ）。 B.分离的消化产物在琼脂糖凝胶上。 C.消化产物的分离毛细管电泳系统; 只有那些片段表示在遗传分析仪上检测的。

笔记

该方案可以与在同一毛细管电泳运行中同时检测简单序列重复（SSR）标记物有效地组合（Perovic等人，2013）。

食谱

凝胶运行缓冲液
1 Tris-Borate-EDTA
89 mM Tris碱
89mM硼酸 2mM EDTA（pH8.0）

致谢

该协议改编自Perovic等人（2013）。

参考文献

Perovic，J.，Silvar，C.，Koenig，J.，Stein，N.，Perovic，D。和Ordon，F。用于毛细管电泳系统上的CAPS基因分型的多功能基于荧光的多重测定法。 a> Mol breed 32（1）：61-69。

Thiel，T.，Kota，R.，Grosse，I.，Stein，N.and Graner，A。（2004）。 SNP2CAPS：用于CAPS标记开发的SNP和INDEL分析工具核 Acids Res 32（1）：e5。