材料和试剂

用Zinpyr-1染色（参见配方）
1. 金属吡啶-I或4' 5'-双[双（2-吡啶基甲基）氨基甲基] -2'，7'-二氯荧光素（C 46 H 36 N 6 Cl 2 N 6 6 O 5，Mr = 823.72 ）（Sigma-Aldrich，目录号：40667或 Millitech，目录号：ZP1）
2. 二甲基亚砜或DMSO（C 2 H 6 OS）
3. 乙二胺四乙酸（二钠盐）（Na 2 EDTA，C 10 H 14 O 8 S N 2 2 2h <2 O，Mr = 372.24）
4. 超级软化水
用Zincon染色（见配方）
1. 锌指钠盐（C 20 H 15 N 15 Si 4 NaO 6 S，Mr = 462.4）（Sigma-Aldrich ，目录号：201332）
2. 硼砂（Na 2 B 4 B 4 O 7·10 H 2 O）
3. 氢氧化钠（NaOH）
4. 乙二胺四乙酸二钠盐（Na 2 EDTA，C 10 H 14 O 8 S N 2，/sub> 2 sub 2 H sub 2 O，Mr = 372.24）
5. 超级软化水

设备

光学显微镜与彩色数码相机附件（用Zincon染色）; 共聚焦显微镜或荧光显微镜，具有适当的过滤器和数码相机附件（用Zinpyr-1染色;关于染料的光谱特性参见下文）
微量移液器（100-1,000μl）和移液器吸头
涡流
精确余额
剃刀刀片
50ml，100ml和1L烧瓶中
2 ml微量管
5ml或15ml离心管
耐热20ml烧瓶
显微镜载玻片和盖玻璃
镊子
解剖针
带加热的磁力搅拌器
Axio Imager Z2显微镜（ZEISS）

程序

植物材料的制备
为了去除在根表面上吸收的金属，根应该在Na 2 EDTA-EDTA（20mM）中温育10分钟，然后在分析前在软化水中漂洗。为了制备20mM Na 2 EDTA溶液，将7.44g Na 2 EDTA溶解在1L软化水中。
染色程序
1. 在玻璃载玻片上制作系列检查植物材料的切片使用安全剃刀刀片。最佳厚度约为1-2完整细胞，但它取决于植物材料。叶片表皮可以剥离用镊子。重要的是使用新鲜的活植物材料。它是不利于分析固定植物组织中锌的分布到部分细胞Zn的潜在再分布或洗出在化学固定的过程中。例如，大损失（up 至75-80％）从根到固定剂的松散结合的锌脱水溶液在组织制备期间通过常规固定对于电子显微镜已经由Davies等人（1991）记录。
2. 加入3-4滴分析试剂。
3. 用盖玻片覆盖这些部分或皮。如果需要，请删除过量试剂与滤纸。如果在考试期间试剂在载玻片上干燥，应将其加到盖子下面玻璃。
显微镜

使用Zinpyr-1染色
在孵化期间保持在黑暗中的制剂。可以在共聚焦扫描荧光显微镜或荧光显微镜下在15-60分钟后检查制剂（取决于植物材料的大小和量）。 Zinpyr-1的激发和发射最大值都在可见光谱内：490和525nm。我们使用Axio Imager Z2显微镜的滤光片组38，激发波长范围为450-490nm，发射波长范围为500-550nm。为了避免背景荧光，重要的是在使用滤纸处理后用载玻片除去Zinpyr-1溶液，并用超级矿物质的水代替。植物组织中Zn的位置由Zn-Zinpyr-1复合物的绿色荧光指示（图1A-C）。

使用Zincon染色
可以在光学显微镜下在5-15分钟后检查制剂（取决于植物材料的大小和量）。准备时间不能超过几个小时。植物组织中Zn的位置由Zn-Zincon复合物的蓝色指示（图1D-G）。

代表数据

图1.使用Zincpyr-1（AC）和Zincon（DG）的Zn在植物组织中的定位。 A.根部，B.根，C.叶片的叶柄部分暴露于20μMZn 8周; D.根部，
使用Zinpyr-1染色
在孵化期间保持在黑暗中的制剂。可以在共聚焦扫描荧光显微镜或荧光显微镜下在15-60分钟后检查制剂（取决于植物材料的大小和量）。 Zinpyr-1的激发和发射最大值都在可见光谱内：490和525nm。我们使用Axio Imager Z2显微镜的滤光片组38，激发波长范围为450-490nm，发射波长范围为500-550nm。为了避免背景荧光，重要的是在使用滤纸处理后用载玻片除去Zinpyr-1溶液，并用超级矿物质的水代替。植物组织中Zn的位置由Zn-Zinpyr-1复合物的绿色荧光指示（图1A-C）。

使用Zincon染色
可以在光学显微镜下在5-15分钟后检查制剂（取决于植物材料的大小和量）。准备时间不能超过几个小时。植物组织中Zn的位置由Zn-Zincon复合物的蓝色指示（图1D-G）。

代表数据

图1.使用Zincpyr-1（AC）和Zincon（DG）的Zn在植物组织中的定位。 A.根部，B.根，C.叶片的叶柄部分暴露于20μMZn 8周; D.根部，...

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Notes

To prove that green fluorescence observed after staining with Zinpyr-1 or blue coloring observed after staining with Zincon are Zn-dependent indeed, tissue sections can be incubated in a 1mM-solution of TPEN [N, N, N', N'-tetrakis (2-pyridylmethyl)ethane-1, 2-diamine] for 2 h at room temperature prior to staining with Zinpyr-1 or Zincon. TPEN is a chelator capable of penetrating cell membranes and showing high affinity and specificity toward Zn ions. Treatment of samples with TPEN should lead to almost complete absence of Zn-dependent green fluorescence after subsequent treatment with Zinpyr-1 or absence of blue staining after subsequent treatment with Zincon.
The intensity of staining corresponds with the level of Zn accumulation in cells and tissues. Therefore, it is possible to semi-quantitatively estimate and compare the Zn contents within and among sections on a per unit area basis. The Zn contents of cells of different tissues can be compared only if the cell sizes in these tissues are similar. In particular, when Zn distribution in the growing parts of plants is analyzed, one should take into consideration that the reduced staining intensity of elongating cells, as compared with meristematic cells, may point to a decrease in the Zn content in elongating cells only on a per unit volume basis. The Zn content per cell may be the same or even higher as a result of ongoing Zn uptake during the elongation phase.
In our hands, Zincon staining was visible at Zn concentrations of 10 μM or higher. The threshold Zn concentration of the fluorescence method (Zinpyr-1), as determined by analysis of the emission spectrum of Zinpyr-1 at various Zn concentrations, was 1 nM. One should bear in mind that the lack of coloration of certain tissues or organs only means that the Zn content in the tissues is below the detection limit of the histochemical method. However, plants can accumulate Zn at concentrations that are one or more orders of magnitude higher than in their nutrient or soil solution. Therefore, even when the Zn concentration in the medium is identical to or below the detection limit of these histochemical methods, the Zn content within the plants will most likely be sufficient for detection.

食谱

用Zinpyr-1染色
1. 为了制备1mM的Zincpyr-1储备溶液，将500mg的1mg的Zinpyr-1溶解 μl的DMSO，使用涡旋混合器充分搅拌，吸取溶液加入2ml微量管中，加入714μlDMSO。再次涡旋。使将50μl等份的Zinpyr-1储备溶液并储存在冷冻箱中在-20℃
2. 在分析之前，稀释等分试样 Zinpyr-1 DMSO储备溶液（1mM）至终浓度为5或10 μM的超级矿物水。制备5ml10μM的Zincpyr-1 工作溶液溶解50μl在4.95中的Zinpyr-1 DMSO储备溶液 ml超顺磁水。或者，制备5ml的5μM Zinpyr-1工作溶液溶解25μl的Zinpyr-1 DMSO储备溶液在4.975ml超高温矿化水中。
用Zincon染色
1. 为了制备50毫升1M NaOH储备溶液，将2克NaOH溶解在50毫升超纯矿泉水中。
2. 为了制备10ml的工作溶液，溶解0.0065g的Zincon和 0.1906g硼砂在9ml超高温矿化水中的溶液。加入0.2ml 1M NaOH并用超纯水调节体积至10ml
3. 在加热的磁力搅拌器上将溶液加热至80-90℃ 然后冷却至室温。可以存储该解周在黑暗中室温。

致谢

这项工作是由俄罗斯基础研究基金会（RFBR，＃11-04-00513，15-04-02236）的支持。我们感谢V. Ivanov教授和A. Voronkov博士进行富有成果的讨论。使用Zinpyr-1的Zn染色的方案从S.A.Sincclair博士和合作者的工作（2007）修改。

参考文献

Davies，K.L.，Davies，M.S.and Francis，D。（1991）。锌诱导的根分生细胞中的空泡化 Festuca rubra L. Plant Cell Environ 14（4）：399-406。
Kozhevnikova，A.D.，Seregin，I.V.，Erlikh，N.T.，Shevyreva，T.A.，Andreev，I.M.，Verweij，R.and Schat，H。（2014a）。组氨酸介导的木质部锌负载是一种物种范围的特征，在N藜（Noccaea caerulescens） New Phytol 203（2）：508-519。
Kozhevnikova，A.D.，Erlikh，N.T.，Zhukovskaya，N.V.，Obroucheva，N.V.，Ivanov，V.B.，Belinskaya，A.A.，Khutoryanskaya，M.Y.and Seregin，I.V。（2014b）。镍和锌的影响，在ruderal植物中的积累和分布 Lepidium ruderale 36（12）：3291-3305。
Seregin，I。和Kozhevnikova，A。（2008）。根和芽组织在镉，铅，镍和锶的运输和积累中的作用。 Russ J Plant Physiol 55（1）：1-22。
Seregin，I。和Kozhevnikova，A。（2011）。用于检测高等植物组织中重金属和锶的组织化学方法。 Russ J Plant Physiol 58（4）：721-727
Seregin，I.，Kozhevnikova，A.，Gracheva，V.，Bystrova，E。和Ivanov，V。（2011）。玉米幼苗根系中的组织锌分布及其对生长的作用。 Physiol 58（1）：109-117。
Sinclair，S.A.，Sherson，S.M.，Jarvis，R.，Camakaris，J.and Cobbett，C.S。（2007）。使用锌荧光团，Zinpyr-1，在拟南芥根中对锌稳态的研究。新植物 174（1）：39-45。