材料和试剂

不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H2387）
胶原酶II型（Sigma-Aldrich，目录号：C6885-500MG）
胎牛血清（FBS）（EuroClone，目录号：ECS0180L）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号T6146-5G）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Life Technologies，目录号：14190-250）
来自人血浆0.1％溶液（测试的细胞培养物）（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）的纤连蛋白
不含NaHCO 3的改良的Eagle培养基（MEM）Joklik（Sigma-Aldrich，目录号：M0518）
Hepes（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
牛磺酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0625）
青霉素 - 链霉素（100x溶液稳定，无菌过滤，适用于细胞培养）（Sigma-Aldrich，目录号：P4333-100ML）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I5523-50MG）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）低葡萄糖（Life Technologies，Gibco ，目录号：31600-091）
MCDB-201（Sigma-Aldrich，目录号：M6770）
亚油酸 - 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：L9530）
地塞米松（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：D2915）
抗坏血酸-2磷酸盐（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：A8960）
100x胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：41400-045）
干细胞测试的胎牛血清（Stem Cells Technologies，目录号：10M37180）
人血小板衍生生长因子-BB（hPDGF-BB）（Pepro Tech，目录号：100-14B）
人表皮生长因子（hEGF）（Pepro Tech，目录号：AF-100-15）
TrypLE-表达解离试剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：12605）
基本缓冲区（BB）（参见配方）
孵育缓冲液（IB）（参见配方）
0.025％II型胶原酶（见配方）
0.4％台盼蓝溶液（见配方）
纤连蛋白包被的100mm培养皿（参见配方）
多能成体干细胞（MASC）培养基（参见配方）

设备

将100×20mm样式的无菌组织培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353003）
手术刀（Sigma-Aldrich，目录号27046）
无菌血清学转移移液器
血清移液器
无菌猎管
网孔过滤器（70μm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号352350）
生物罩（更快，型号：Safe FAST Elite）
搅拌转子（Celbio，型号：MINI OVEN）
Burker计数室（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629-1EA）
37℃，5％CO 2，5％O 2强制空气培养箱（New Brunswick，型号：Galaxy 170 R）
离心机（Heraeus Instruments，型号：Megafuge 1.0R）
光学显微镜（Leica Microsystems，型号：DMIL）

程序

人神经胶质瘤原始细胞的分离和原代培养（见视频1）
1. 在生物罩下，将胶质瘤样品置于无菌的100mm培养皿中并使用手术刀将碎片切成〜1毫米的块
2. 重新悬浮胶质瘤片段到3-5毫升BB，并将他们转移到15毫升Falcon管。
3. 让片段沉积到15毫升Falcon管的底部重力在室温。如果碎片不会沉积到底部，将悬浮液在300×g离心1分钟
4. 取出上清液，并在等体积的胶原酶溶液（0.025％）中重悬浮沉淀的体积。
5. 在37℃的搅拌转子中孵育悬浮液5分钟
6. 在孵化期结束时，轻轻摇动底部 Falcon管并加入5毫升IB，轻轻地用10毫升吸管血清移液器4-5分钟
7. 通过预湿润70微米的网过滤器使用5ml无菌血清学过滤5ml无菌，新鲜HBSS 移液至50ml Falcon管中
8. 通过预湿的70μm网过滤器过滤细胞悬液
9. 在室温下将过滤的悬浮液在500×g离心5分钟，并将其重悬浮在1ml MASC培养基中。
10. 计数细胞使用Burker计数室：删除10μl的细胞悬浮液，将其与等体积的0.4％台盼蓝混合 D-PBS并将10μl稀释的细胞应用于Burker室。计数至少四个正方形并通过乘以计算细胞的数量对于2×10 4个中值获得。您将获得总金额细胞/ml细胞悬浮液
11. 种子5,000个细胞/cm 2 纤维连接蛋白包被的培养皿，并在37℃下在MASC培养基中培养 5％CO 2 2，5％O 2强制空气培养箱。
胶质瘤相关干细胞（GASCs）的亚培养物
1. 从培养箱（5％CO 2，5％O 2，在37℃）取出培养皿含有必须分裂的细胞。检查显微镜说细胞已达到80％的汇合（接种后7-10天）
2. 转移在生物罩下面的菜，打开菜和丢弃上清液用10ml无菌血清移液管
3. 添加5 ml的HBSS或D-PBS加入培养皿中，轻轻地移动板以覆盖整个表面，然后去除HBSS或D-PBS。重复洗涤程序。小心取出HBSS或D-PBS。
4. 加入2 ml 的TrypLE Express溶液。因为细胞会非常分离快速，在显微镜连续检查过程，以避免过度消化。
5. 当细胞最终分离时，加入5ml HBSS或D-PBS稀释TrypLE Express溶液。
6. 重新悬浮细胞，轻轻地吸取他们通过10毫升无菌血清移液管。要从菜中回收所有细胞，洗涤培养皿再次通过加入3ml新鲜无菌HBSS或 D-PBS，并将溶液放在含有上述的Falcon管中获得细胞悬液
7. 在500×下离心细胞悬浮液 g，在室温下放置5分钟，弃去上清液将细胞沉淀重悬于1ml MASC培养基中
8. 将细胞以3,500个细胞/cm 2的浓度接种在涂有纤连蛋白的培养皿上。
9. 每三天更换一次培养基。当细胞达到80％汇合时分裂细胞。

代表数据

视频1. GASC隔离过程。视频1表示从1到11的GASCs隔离协议的步骤。

图1.培养物第三代的GASCs的相差图像

食谱

基本缓冲区（BB）
11g MEM Joklik，无NaHCO 3（粉末）
4.7克Hepes（粉末）
0.3g L-谷氨酰胺 0.25克牛磺酸 5ml青霉素 - 链霉素胰岛素20 U/L
加入无热原的dH 2 O至高达900ml，并将pH调节至7.3。
加入无热原的dH 2 O至1000ml并过滤除菌（0.2μm）
储存在4°C
孵育缓冲液（IB）
将10％胎牛血清加入HBSS中
储存在4°C
0.025％II型胶原酶
0.025g II型胶原酶
加入10 ml BB，小心移液2-3分钟
加入BB至100毫升，过滤除菌并储存在-20℃下
0.4％台盼蓝溶液
0.1克台盼蓝
加入25ml无菌1x D-PBS
涡旋并在室温下贮存
纤连蛋白包被的100mm培养皿
对于每个100mm培养皿，在1ml HBSS中加入5μl0.1％纤连蛋白小心地用纤连蛋白溶液覆盖盘的底部，并在室温下保持至少20分钟
从培养皿中除去过量的溶液
多潜能成体干细胞（MASC）培养基
基础培养基（60％DMEM低葡萄糖+ 40％MCDB-201）
2％干细胞测试胎牛血清
10 ng/ml hPDGF-BB
10 ng/ml hEGF
1mg/ml亚油酸BSA 10 ^-9 M地塞米松
1x ITS 100x
10 ^-4 M抗坏血酸-2磷酸盐 1×青霉素 - 链霉素100×
将pH调节至7.3
过滤灭菌（0.2μm）并在4℃下保存

致谢

FIRB Accordi di programma 2011 Pr。 RBAP11Z4Z9。 FIRB计划2011年。 RBAP11ETKA_007。 Programma per la Cooperazione Transfrontaliera Italia-Slovenia 2007-2013。标题："Identificazione di nuovi marcatori di cellule staminali tumorali a scopo diagnico e terapeutico"; AIRC 5 per mille 2011年特别计划， 12214.项目ERC- 7FP SP 2 IDEAS QUIDPROQUO G.A. n。该方案获自Bourkoula等人（2014）。

参考文献

Andolfi，L.，Bourkoula，E.，Migliorini，E.，Palma，A.，Pucer，A.，Skrap，M.，Scoles，G.，Beltrami，AP，Cesselli，D。和Lazzarino，）。通过单细胞力谱和原子力显微镜检查人神经胶质瘤细胞的粘附和力学性质。/a> PLoS One 9（11）：e112582。
Beltrami，AP，Cesselli，D。，Bergamin，N.，Marcon，P.，Rigo，S.，Puppato，E.，D'Aurizio，F.，Verardo，R.，Piazza，S.and Pignatelli，（2007）。多能细胞可以在体外从几个成人器官（心脏）产生，肝和骨髓）。血液 110（9）：3438-3446。
Bourkoula，E.，Mangoni，D.，Ius，T.，Pucer，A.，Isola，M.，Musiello，D.，Marzinotto，S.，Toffoletto，B.，Sorrentino，M.，Palma， Caponnetto，F.，Gregoraci，G.，Vindigni，M.，Pizzolitto，S.，Falconieri，G.，De Maglio，G.，Pecile，V.，Ruaro，ME，Gri，G.，Parisse， Casalis，L.，Scoles，G.，Skrap，M.，Beltrami，CA，Beltrami，AP和Cesselli，D。（2014）。胶质瘤相关干细胞：一种新型的能够预测人类低度预后的肿瘤支持细胞 - 等级神经胶质瘤。干细胞 32（5）：1239-1253。