材料和试剂

五至六周龄的N的植物。本bentiana
农杆菌菌株：ABI（Zhang等人，2006）
质粒[pBA-2Flag-4Myc-DCL1，pBA-6Myc-HYL1，pBA-6Myc-SE。详细方法可以参考来自Zhu等人的在线方法（2013）。阴性对照质粒：pBA]
G-Tube 卡帽硅化微量离心管（VWR International，目录号：22179-004）
抗FLAG磁珠（Sigma-Aldrich，目录号：M8823）
3x Flag肽（NH2-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-COOH）（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
DNase（Promega Corporation，目录号：M6101）
3,000 Ci/mmol 10mCi/ml [γ-32 P] -ATP（PerkinElmer，目录号：BLU502A100UC）
Superase In RNA酶抑制剂（Ambion，目录号：N8080119）
T7 RNA聚合酶（Ambion，目录号：18033019）
小牛肠碱性磷酸酶（NEB，目录号：M0290S）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15593049）}
NaAc（Sigma-Aldrich，目录号：S7670）
5M乙酸铵（Ambion，目录：AM9071）
GlycoBlue（Ambion，目录号：AM9516）
十进制标记（Ambion，目录号：AM7778）
抗c-Myc琼脂糖亲和凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：A7470）
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：05892953001）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P2714）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
DTT（DL-二硫苏糖醇）（Sigma-Aldrich，目录号：43817）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
NTP（Thermo scientific，目录号：R0481）
去离子甲酰胺（Ambion，目录号：AM9342）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
二甲苯Cyanol（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：V900106）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
DEPC（Sigma-Aldrich，目录号：V900882）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900068）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900312）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V900502）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900058）
ATP（Thermo scientific，目录号：R1441）
GTP（Thermo scientific，目录号：R1461）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：V900122）
0.1M甘氨酸-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：55097-5ML-F）
5x转录缓冲液（见配方）
RNA加载缓冲液（参见配方）
RNA洗脱缓冲液（参见配方）
DEPC H ₂ O（参见配方）
RNA溶解缓冲液（见配方）
氯仿：异戊醇（24：1）（参见配方）
IP缓冲区（参见配方）
蛋白酶抑制剂混合物（见配方）
TBS缓冲区（请参阅配方）
3x Flag洗脱缓冲液原液（4mg/ml）（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
测试缓冲区（参见配方）
修复缓冲区（请参阅配方）

设备

紧凑型UV灯（UVP，型号：UVGL-25）
氟涂覆的TLC板（10×10cm）（Ambion，目录号：AM10110）
盖革计数器（Medcom，型号：CRM-100）
垂直电泳系统（Whatman，型号：V15.17）
Thermomixer C（Eppendorf，型号：5382000023）
凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：583）
凝胶分析仪Quantity One（Bio-Rad Laboratories，版本：4.6.9）
DynaMag ^TM -2（Life technologies，型号：12321D）
坚固的旋转器（Glas-Col，型号：099A MR1512）
PolyATtract System 1000磁力分离架（Promega公司，型号：Z541A）
Phospho成像仪（PharosFX ^TM plus系统）

程序

注意：请参见图1，了解以下六个步骤的示意图。

图1.过程示意图

制备pri和pre-miRNA转录物（Han等人，2014）

pri和pre-miRNA的底物在T7启动子下在体外使用PCR产生的模板转录。在这种情况下，正向PCR 引物应含有T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAG）驱动直接从PCR产物转录

按照以下步骤准备体外转录反应：

试剂	卷	最终浓度。
纯化的PCR产物（100ng）	- 微博
5x转录缓冲液	4微升
Superase-In	1微升	1 U /μl
T7 RNA聚合酶	2微升
将H sub 2 O加到最终体积20μl 中	20微升

注意：其他商业供应商也提供体外转录试剂盒。

短暂旋转。在37℃孵育3小时或过夜
加入1μlDNA酶。混合并在37℃下离心30分钟
加入20微升RNA加载缓冲液到转录的RNA。
将管在95℃下加热2分钟。在冰上冷却2分钟。
在4℃下短暂旋转试管。保持样品在冰上，直到加载
同时，制备6％的脲 - 聚丙烯酰胺凝胶
在装载样品前，冲洗6％脲 - 聚丙烯酰胺凝胶用1x TBE运行缓冲液除去扩散的尿素
加载RNA样品在6％脲 - 聚丙烯酰胺凝胶并在350V（20V/cm）下运行直至溴酚蓝色到达凝胶的底部
从凝胶中取出一块玻璃板。
应用UV阴影定位誊本的位置然后切除pre-miRNA或pre-miRNAs条带的单个条带的凝胶切片。
UV阴影：从用于的玻璃板上除去凝胶电泳并将其放置在一片塑料包装上。然后定位在氟涂覆的TLC板的顶部上的塑料包装和凝胶（注意：避免皮肤和眼睛暴露在紫外线下）。使用手持式UV监视器，识别具有可区分阴影和标记的带如果要切割凝胶的话，感兴趣带的位置进一步净化。
将凝胶切片放入带有350μlRNA洗脱缓冲液的1.5ml管中
使用Thermomixer C在42℃下用1200rpm振荡孵育试管过夜
将混合物在4℃离心10分钟
将上清液（约300μl）转移到新管中
加入100微升RNA洗脱缓冲液到老管用凝胶切片，涡旋和离心5分钟
将上清液混合到先前收集的上清液中（步骤A16）
向总上清液中加入1μl糖原蓝和1ml 99.7％冰冷的乙醇
混合并置于-20℃下过夜或在-80℃下放置30分钟
在4℃下以16,000×g离心管15分钟。
用500μl75％冰冷的乙醇洗涤蓝色沉淀，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟，并除去乙醇。
快速旋转管，小心除去残留的乙醇
空气干燥沉淀5分钟。
将RNA沉淀重悬在21μl的DEPC H 2 O中。测量浓度和计算摩尔浓度。通常，1微克150 nt RNA 大约等于20pmol。
将RNA样品的最终浓度调整为5μM（5 pmol /μl或250 ng /μl）
将RNA储存于-80℃

去除pri和pre-miRNA的5'磷酸酯
1. 在4℃下，在新管中混合：1μlRNA（5 pmol），2μl10x NEB缓冲液3，2μlNEB小牛肠碱性磷酸酶（CIP），1 μl的Superase-In（终浓度1U /μl），DEPC H 2 O14μl。
2. 在37℃孵育30分钟。
3. 向上述反应混合物中加入220μlDEPC H sub 2 O
4. 加入240μl苯酚：氯仿：异戊基：醇（25:24:1）和涡旋30秒。在室温离心5分钟，收集210μl水相。
5. 加入210μl氯仿：异戊醇（24：1）并涡旋 30秒。在室温离心5分钟，收集170μl水阶段
6. 加入510μl的99.7％冰冷的乙醇，17μl3M NaAc（pH 5.2）和1μl的糖原蓝。混合并在-20℃下离心过夜 ℃或30分钟，在-80℃
7. 在4℃下以16,000xg离心15分钟。
8. 小心除去上清液。
9. 用500μl75％冰冷的乙醇洗涤蓝色沉淀，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟，并除去乙醇
10. 空气干燥沉淀5分钟。
11. 将RNA沉淀重悬于4.5μlDEPC H 2 O中。
5'端对pri-和pre-miRNA的放射性标记（该步骤必须在放射性同位素指定空间中进行，并进行适当的安全培训）
1. 将以下物质在4℃的新管中混合：4.5μlRNA（来自步骤B），1 μl的10×NEB T4激酶缓冲液，3μl的[γ-32 P] -ATP（3,000Ci/mmol 10 mCi/ml），0.5μlSuperase-In（终浓度1U /μl）和1μl NEB T4激酶
2. 将反应混合物在37℃下孵育2小时。
3. 向上述反应混合物中加入230μlDEPC H 2 O
4. 加入240μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和涡旋30秒。在室温离心5分钟，取210μl水相。
5. 加入140微升5 M醋酸铵，1微升糖原蓝和1,050μl的99.7％冰冷乙醇。混合并离开管在-20℃下过夜或在-80℃下30分钟。
6. 在4℃下以16,000xg离心15分钟。
7. 小心除去上清液。
8. 用500μl75％冰冷的乙醇洗涤蓝色沉淀，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟，并除去乙醇
9. 风干球团5分钟。
10. 向管中加入20μlRNA加样缓冲液以溶解沉淀。这里可以存储在-20°C
11. 制备6％的脲 - 聚丙烯酰胺凝胶
12. 将管在95℃下加热2分钟。在冰上冷却2分钟。
13. 短暂地向下旋转管。
14. 使用运行缓冲液冲洗孔以除去扩散的尿素。
15. 将RNA样品装载在6％尿素-AGE凝胶上并在350V（20V/cm）下运行，直到溴酚蓝到达凝胶底部。
16. 从凝胶中取出一块玻璃板。请务必标记位置和取向，使得凝胶可以对准该膜一旦被显影。用塑料包装包裹凝胶在凝胶上放置磷光成像器30分钟。放射性标记转录物将在显影胶片上显示为强带
17. 将照片与凝胶对齐，切出含有的凝胶切片标记的转录物。将凝胶切片放入一个1.5毫升的新鲜管350微升的RNA洗脱缓冲液
18. 使用Thermomixer C在42℃下用1200rpm振荡孵育试管过夜
19. 将上清液（约300μl）转移到新管中
20. 加入100微升RNA洗脱缓冲液到老管用凝胶切片和涡流
21. 将上清液转移到之前的上清液中
22. 向总上清液中加入1μl糖原蓝和1ml 99.7％冰冷乙醇
23. 混合并在-20℃下放置过夜，或在-80℃下放置30分钟
24. 在4℃下以16,000×g离心管15分钟。
25. 用500μl75％冰冷的乙醇洗涤蓝色沉淀，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟，并除去乙醇。
26. 快速旋转管，小心除去残留的乙醇
27. 风干球团5分钟。小心不要过度干燥颗粒。
28. 计数cpm和重悬20μLRNA溶解的放射性标记的RNA 缓冲。使放射性标记的RNA在95℃加热块中变性2 min，然后取出整个95°C的块，慢慢折叠RNA 将加热块冷却至室温。储存放射性标记 RNA在-20°C。
拟南芥DCL1复合体在N中的异源表达。本bentiana
1. 渗透 N。本生烟叶具有土壤杆菌的OD 600 = 1混合物包含pBA-2Flag-4Myc-DCL1，pBA-6Myc-HYL1， pBA-6Myc-SE，OD 600分别为0.8,0.1和0.1。作为否定控制我们使用 A。包含空载体pBA的根瘤土壤杆菌 ABI菌株只有。
2. 两天后，收集浸润的叶子，在液氮中研磨，并储存在-80℃
免疫沉淀DCL1微处理器
1. 确保将离心机和转子冷却至4°C
2. 在5体积的IP中重新悬浮本塞姆氏烟草粉末样品缓冲液（通常为3g样品在15ml IP缓冲液中）; 保持在冰和防止光照（使用铝箔包裹管），直到样品完全解冻。转移溶液到15毫升锥形
3. 在4℃下以16,000×g离心样品15分钟。将所有上清液转移至新的冷却的15ml管中。
4. 在4℃下以16,000×g离心15分钟。将所有上清液转移到另一新的冷却的15ml试管中
5. 在离心步骤期间制备抗Flag抗体免疫沉淀。加入400μl床体积抗FLAG ^？ M2磁珠（对于3g植物组织）放入新的2ml Eppendorf管中。
6. 将Eppendorf管装入磁分离器DynaMag ^TM -2以收集珠子。快速删除存储缓冲区。
7. 从DynaMag ^TM -2释放管，并除去不是的抗体通过孵育抗-FLAG M2偶联到DynaMag珠上磁珠与一床体积的0.1M甘氨酸-HCl（pH 3.0）。
8. 将管反转1.5分钟（完全）。
9. 将Eppendorf管装入DynaMag ^TM -2，快速分离并除去甘氨酸-HCl缓冲液。
10. 使用DynaMag ^TM -2，用1ml TBS缓冲液快速平衡抗FLAG ^？ M2磁珠3次。
11. 用1ml IP缓冲液洗涤珠子三次，使用DynaMag -2。
12. 完全删除IP缓冲区，并添加400μl新的IP缓冲液到管中以重悬浮珠。
13. 将平衡的珠子添加到步骤E4的15ml管中。
14. 然后使用Rugged Rotator在4℃下旋转15ml管2小时。
15. 在用抗-FLAG M2磁珠进行第一步免疫沉淀时，制备用于第二步的抗Myc抗体免疫沉淀。
16. 加入120微升床体积的抗c-myc琼脂糖亲和凝胶到一个新的1.5毫升管。然后，用1ml IP缓冲液洗涤凝胶
17. 在4℃下在1,600×g下旋转管1分钟。弃去上清液。
18. 重复洗涤两次。
19. 取大部分洗涤缓冲液，并将抗c-myc琼脂糖亲和凝胶置于冰上
20. 在步骤E14结束时，制备3×Flag肽溶液 Flag-Myc标记的DCL1从抗-FLAG M2磁珠的洗脱。
21. 加入30μl3×Flag洗脱缓冲液储备液（4 mg/ml）到1.2 ml IP 缓冲液，使最终浓度为100μg/ml的3×Flag肽。混合把它放在冰上。
22. 在步骤E14之后，加载15ml （步骤E14）在PolyATtract 系统1000磁分离站立几秒钟，然后缓慢倒入上清液到垃圾桶可以。
23. 用IP缓冲液洗涤15 ml锥形管的壁，直到上清液不再是绿色，通常是三次。为了这，使用磁性支架。
24. 加入2毫升IP缓冲液到锥形管。
25. 将所有珠子小心地转移到一个干净的2毫升Eppendorf管
26. 将2ml管装入DynaMag ^TM -2，并取出IP缓冲液
27. 加入600μl3×Flag洗脱缓冲液到2ml管中，在4℃下旋转孵育30分钟。
28. 将2ml管装入DynaMag ^TM -2。将上清液（1μL洗脱溶液）转移到含有抗c-myc的1.5ml Eppendorf管中琼脂糖亲和凝胶（步骤E19）。然后，开始第二个IP孵化第二管在4℃下旋转
29. 添加另外600μl3x标志洗脱缓冲液至抗标磁珠并进行第二次在4℃洗脱30分钟
30. 收集第二次洗脱的抗Flag IP，将2ml Eppendorf管放入DynaMag TM -2。将第二次洗脱与第一次洗脱在1.5ml管中含有抗c-myc琼脂糖亲和凝胶（步骤E28）。
31. 通过在4℃下旋转1.5ml管1.5小时继续第二IP步骤。
32. 离心含有抗c-myc琼脂糖亲和力的1.5ml管凝胶（步骤E30）以1,600×g在4℃下3分钟。除去上清液。
33. 洗掉来自抗c-myc琼脂糖的非特异性结合通过加入1ml IP缓冲液并倒置管6-7次来制备亲和凝胶。在4℃下以1600×g离心3分钟并除去缓冲液。
34. 将亲和凝胶重悬在1ml IP缓冲液中，并分装到8个新的1.5ml硅化试管中。
35. 在4℃下，在1,600×g下旋转8根管子3分钟。
36. 尽可能完整地删除缓冲区。
37. 保持八管在冰上在体外 DCL1重建测定，因为这些纯化的DCL1复合物准备用于体外测定。
  注意：我们在每次测定前立即准备新鲜的免疫沉淀物。
体外 DCL1重建测定（该步骤必须在放射性同位素指定空间内进行，并进行适当的安全培训）
1. 小心加入14μl新鲜的测定缓冲液和1μl放射性标记 pri-miRNA（约2×10 3 cfu）加入含有8个管中免疫沉淀。轻轻地重新悬浮琼脂糖凝胶反应混合物。
2. 使用Thermomixer C在37℃，900rpm摇动下孵育管1小时
3. 每5分钟轻轻混匀反应。
4. 1小时后，加入170μlRNA洗脱缓冲液终止测定
5. 加入200μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）并涡旋30秒。
6. 在室温离心5分钟。
7. 将150μl上层水相转移到硅化试管中。
8. 加入20微升3 M NaAc（pH 5.2），1微升糖原蓝，和1毫升 100％冰冷乙醇。倒置管几次，离开它在-20℃过夜。
9. 在4℃下以16,000xg离心15分钟。
10. 小心弃去上清液。
11. 用500μl75％冰冷的乙醇洗涤蓝色沉淀，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟，并除去乙醇
12. 快速旋转管，用移液管除去残余乙醇
13. 空气干燥沉淀5分钟。
14. 用20μlRNA加样缓冲液悬浮沉淀。样品现在可以储存在-20°C
15. 将管在95℃下煮沸1分钟。在冰上冷却2分钟。
16. 简短地向下旋转管。
17. 准备15％的尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶，冲洗凝胶的孔以除去扩散的尿素，然后装载样品。
18. 将测定样品和RNA标记物装载在15％脲 - 聚丙烯酰胺上凝胶。 RNA标记应该根据5'-end标记使用[γ-³² P] -ATP的制造商方案
19. 在350V（20V/cm）下运行约1小时，直到溴酚蓝到达凝胶底部
20. 拆卸凝胶。
21. Place the gel into a tank containing fixing buffer for 30 min.
22. Dry the gel with a Gel Dryer under the gradient cycle at 80 °C for 2-4 h.
23. Cover the dried gel with plastic wrap and place a phosphate screen on the gel for 2 h or overnight.
24. The processed RNA products will appear as a strong band on phospho imager (PharosFX^TM Plus System) and quantified with Quantity One Version 4.6.9 according to the manufacturer’s instructions.

Representative data

Representative data could refer to the Figures 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 from Zhu et al. (2013), as well as supplementary Figures 2, 3, 4, 5, 6 and 9.

Notes

The E and F steps should be performed successively in one day.
The C and F steps must be performed in a radioisotope-designated space and with the appropriate safety training.

Recipes

5x transcription buffer
400 mM HEPES (pH 7.5)
10 mM spermidine
200 mM DTT
125 mM MgCl₂ and 20 mM of each NTP
RNA loading buffer
95% deionized formamide
0.025% bromophenol blue
0.025% xylene cyanol
5 mM EDTA and 0.025% SDS
RNA elution buffer
0.3 M NaAc (pH 5.2) and 2% SDS
DEPC H₂O
Add 1 ml of DEPC to 1 L of H₂O, shake vigorously and autoclave.
RNA dissolve buffer
100 mM KCl
30 mM Tris-HCl (pH 7.5)
Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)
Chloroform 96 ml
Isoamyl alcohol 4 ml
IP buffer
40 mM Tris-HCl (pH 7.5)
300 mM KCl
5 mM MgCl₂
5 mM DTT
0.2 mM EDTA (pH 8.0)
0.2% Triton X-100
1 mM PMSF
2% glycerol
0.3% (vol/vol) protease inhibitor cocktail stock
1 tablet per 25 ml IP buffer of EDTA-free protease inhibitor cocktail
Protease inhibitor cocktail stock
Protease inhibitor cocktail (about 89 mg) is dissolved in 10 ml ddH₂O
TBS buffer
50 mM Tris HCl (pH 7.4)
150 mM NaCl
3x Flag elution buffer stock (4 mg/ml)
Add 4 mg 3x Flag peptide into 1 ml IP buffer
Washing buffer
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 mM DTT
4 mM MgCl₂ and 100 mM KCl
Assay buffer
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
4 mM MgCl₂
1 mM DTT
10 mM ATP
2 mM GTP
2 U/μl Supernase-In
Fixing buffer
40% ethanol
10% acetic acid and 5% glycerol

Acknowledgments

This work was supported by grants from the US National Science Foundation (NSF) CAREER (MCB-1253369), the US National Institutes of Health (R21AI097570) and the Welch foundation (A-1777) to X.Z, and also supported by Chinese Universities Scientific Fund (2014RC006) to H.Z.

References

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Zhu, H., Zhou, Y., Castillo-Gonzalez, C., Lu, A., Ge, C., Zhao, Y. T., Duan, L., Li, Z., Axtell, M. J., Wang, X. J. and Zhang, X. (2013). Bidirectional processing of pri-miRNAs with branched terminal loops by Arabidopsis Dicer-like1. Nat Struct Mol Biol 20(9): 1106-1115.