材料和试剂

QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：51306）
硝化纤维素膜（GE Healthcare，目录号：10600003）
Whatman滤纸3MM Chr（Whatman，目录号：3030-917）
针对CPD的小鼠单克隆抗体（Kamiya，目录号：MC-062）
针对6-4PP的小鼠单克隆抗体（COSMO BIO，目录号：NMDND002）
过氧化物酶亲和山羊抗小鼠IgG（H + L）（Jackson Laboratories，目录号：115-035-003）
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies，目录号：S-11494）
核糖核酸酶A（100mg/ml）（Bio Basic Canada Inc.，目录号：RB0473）
乙醇（Burdick& Jackson，目录号：RP090-1）
PBS（Bio Basic Canada Inc.，目录号：PD8117）
叠氮化钠（Junsei Chemical co。，目录号：26628-22-8）
NaOH（Bio Basic Canada Inc.，目录号：SB0617）
EDTA（USB公司，目录号：6381-92-6）
乙酸铵（NH 4 Ac）（Katayama Chemical，目录号：01-4400）
乙酸（CH 3 COOH）（Merck Millipore，目录号：64-19-7）
NaCl（Bio Basic Canada Inc.，目录号：DB0483）
柠檬酸钠（Bio Basic Canada Inc.，目录号：CB0035）
HCl（Duksan PureChemicals，目录号：1129）
Tris碱（Bio Basic Canada Inc.，目录号：TB0196）
Tween-20（Bio Basic Canada Inc.，目录号：9005-65-5）
脱脂奶粉（Sigma-Aldrich，目录号：M7409-1BTL）
Pierce ^TM ECL Plus Western Blotting Substrate（Life Technologies，目录号：32132）
0.4M NaOH + 10mM EDTA缓冲液（参见配方）
2 M醋酸铵（见配方）
SSC（请参阅配方）
TE缓冲区（参见配方）
PBS-T（参见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
初级抗体稀释缓冲液（参见配方）
第二抗体的缓冲液（参见配方）

设备

紫外线照射器（UVP，目录号：CL-1000）
UV-C传感器（UVP，目录号：97-0016-01）
Bio-Dot SF微量过滤装置（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6542）
真空压力泵（Gardner Denver Welch Vacuum Technology Inc.，目录号：2522C-10）
真空干燥机（JS Research Inc.，目录号：JSVO-30T）
轨道摇床（Wisd Laboratory Instruments，目录号：SHO-1D）
NanoDrop（Beckman Coulter，目录号：DU-730）
热块（Wealtec Corp.，目录号：HB-1）
Gel doc（Bio-Rad Laboratories，目录号：75S/01085）
离心机（Hanil Science Industrial，目录号：Smart R17）
微量离心管（SPL，目录号：60015）
12通道多点移液器（HTL LAB Solutions，目录号：5127）
纸张强制（USBECK，目录号：3110）
X射线胶片8×10英寸（Fujifilm Corporation，目录号：HR-U30）
X-ray Cassette-AFAB TYPE 8×10英寸（JPI，目录号：AFAB8x10）

程序

细胞培养和紫外线照射
1. 使细胞在6孔板中生长汇合
2. 取出培养基，用1×PBS温育一次，洗涤一次
3. UV照射（254nm UV的10-40J/m 2）注意：在紫外线照射之前需要取下塑料盖。
4. 孵育细胞在培养基中修复指定的时间，然后收获它们修复时间可以根据细胞的修复而变化能力。因此，为了获得CPD的最佳时程 6-4PP修复先进实验用各种时间课程应该执行。以下时间课程是很好的测试未表征的细胞。
  注意：
  的一般修理课程 CPD：无UV，0,6,12,24,48小时
  6-4PPs：无UV，0，1，2，4，8小时。
5. 通过在2,000×g离心30秒，胰蛋白酶消化并收集每个样品在1.5ml微量离心管中。
  细胞沉淀可以在深冷冻器中储存长达1个月，以用于随后的DNA制备。
DNA制备（使用QIAamp DNA Mini Kit）
1. 重悬细胞沉淀在200μl的1×PBS（室温）
2. 加入4μlRNase A（100 mg/ml）
3. 加入20μlQIAGEN蛋白酶K（或蛋白酶）
4. 加入200微升的AL缓冲液，并通过脉冲涡旋混合15秒
5. 在56℃孵育10分钟。
6. 短暂离心以除去盖子内部的液滴。
7. 加入200μlEtOH（100％），并通过脉冲涡旋15秒再次混合
8. 短暂离心以除去盖子内部的液滴。
9. 将混合物加入QIAamp Mini离心柱（在2ml收集管中），不要弄湿边缘
10. 关闭盖子，以6000xg离心1分钟。
11. 将离心柱置于干净的2ml收集管中。
12. 加入500μlAW1缓冲液，离心6,000×g，1分钟。
13. 将离心柱置于干净的2ml收集管中。
14. 加入500μlAW2缓冲液，并以全速（约20,000×em g）离心3分钟。
15. 将离心柱置于干净的1.5 ml E管中
16. 加入200微升AE缓冲液，并在室温孵育5分钟，离心6,000×g，1分钟。
17. 使用NanoDrop测量DNA浓度。
槽印迹（使用Bio-Dot SF微量过滤装置）
1. DNA制备（每个槽300μl总终体积）
  1. 稀释DNA。
    - CPD（50或100ng）→加入150μl0.4M NaOH + 10mM EDTA缓冲液中 - 6-4PP（500ng或1μg）→加入到150μldH 2 O（不包括NaOH缓冲液）中
    注意：我们在总体积300μl中使用50ng或100ng的DNA 0.4M NaOH在10mM EDTA中，用于CPD检测。而6-4PP检测我们使用500μg或1μg的DNA，不用碱处理样品（只使用水）6-4PPs，因为它破坏了6-4PPs）。
  2. 在100℃煮沸10分钟以使DNA变性
  3. 立即将样品转移到冰上。
  4. 向CPD样品中加入150μl冷的2M乙酸铵（pH7.0）以中和DNA（同时DNA在冰上）。
2. 插槽吸墨纸
  1. 在6×SSC中预凝胶3吸印纸（Whatman过滤器3MM纸）和1个硝酸纤维素膜10分钟。
  2. 清洁吸液歧管（在运行的蒸馏水中冲洗）。
  3. 将3个预浸泡的吸墨纸放在歧管的顶部中间板。然后将硝酸纤维素膜放在上面吸墨纸
  4. 将歧管的开槽部分放在膜的顶部。
  5. 夹具使用两个侧件封闭
    
    图1. Bio-Dot SF微量过滤装置组件（通过Bio-Rad实验室）
  6. 将塑料喷嘴拧入设备侧面。
  7. 将真空管连接到喷嘴。
  8. 吸出预浸泡纸和膜渗漏的过量缓冲液
  9. 用400μlTE洗涤膜一次到每个槽（使用多通道移液管）和温和真空。我们建议填充缓冲区每个井在施加真空之前在每个井上提供稳定的压力好。
  10. 小心地将DNA样品装入孔中（使用1,000 p移液管），真空关闭，流量阀打开
    
    图2.将样品装入印迹歧管孔中的示意图
  11. 温和的真空将DNA粘附到膜上
  12. 在每个槽中加入400μl的2x SSC并轻微真空
  13. 拆卸吸液歧管，取出硝酸纤维素膜，将膜放在3米纸之间
  14. 将膜在真空干燥器中在80℃下烘烤2小时。
免疫印迹
1. 浸泡在PBS-T中的印迹膜10分钟，用塑料盒中的50ml PBS-T
2. 将膜转移到30ml封闭缓冲液，并在室温下摇动30分钟
3. 用PBS-T洗涤膜3次（每次5分钟）
4. 应用在PBS-T中用0.02％叠氮化钠稀释1:2000的小鼠CPD或6-4PP一抗
5. 孵育在寒冷的房间的印迹，摇动过夜（12-14小时）
6. 用PBS-T洗涤膜4次，每次15分钟
7. 与第二抗体（抗小鼠IgG HRP缀合的）在室温下在封闭缓冲液中1:2,500稀释1小时轨道振动器
8. 用PBS-T洗涤膜4次，每次15分钟
9. 应用ECL并暴露于胶片。
DNA染色
1. 用PBS-T冲洗膜。
2. 孵育膜用10毫升的含有在PBS-T中1:10000稀释的SYBR-金染料的PBS-T中20分钟在室温下在轨道摇床上
3. 用PBS-T洗涤膜2次，每次5分钟
4. 在UV透照仪下拍摄SYBR金染色的斑点的照片注意：用SYBR-Gold染料检测与膜结合的DNA，并用作上样对照。

代表数据

图3.狭缝印迹修复测定的代表性数据。 XPA是紫外线诱导的DNA损伤的核苷酸切除修复的关键因素。使用siRNA敲低XPA影响CPD和（6-4）PP的修复。对照siRNA靶向亲环蛋白B管家基因。（A和B）XPA水平的降低成比例地影响通过狭缝印迹测定法测量的CPD和（6-4）PP的修复。分析来自用10J/m 2 UV照射的细胞的基因组DNA以在所示的恢复时间期间检测残留的CPD（A）或（6-4）PP（B）。通过用来自用靶向XPA或家族蛋白B（对照，CTRL）的100nM siRNA转染的细胞的指示抗体通过免疫印迹分析人细胞中的蛋白质水平。该数据来自Kang等人（2011）。

食谱

0.4M NaOH + 10mM EDTA缓冲液（500ml） NaOH 8g
0.5M EDTA 10ml 用dH <2> O调整音量以校正音量
2M乙酸铵（pH 7）（500ml）乙酸铵（NH 4 Ac）77.08g
在〜400ml dH 2 O中混合，用乙酸（CH 3 COOH）调节pH至7，然后将体积调节至500ml
储存在4°C
SSC（pH7）
1. 20×SSC（pH7）（1L） NaCl 175.3g
  柠檬酸钠88.2g
  在〜700ml dH 2 O中混合，用HCl调节pH至7，然后将体积调节至1L
2. 2x SSC（1L）
  20x SSC100ml
  dH 2 <900ml
3. 6x SSC（1L）
  20x SSC 300ml
  dH 2 O 700ml
TE缓冲区
1. 1M Tris-HCl缓冲液（pH7.5）1L
  将121.1g Tris与800ml dH 2 O混合用HCl将pH调节至7.5，并将dH 2 O加至1L
2. 10x TE
  1M Tris-HCl（pH7.5）100ml
  0.5M EDTA 20ml dH 2 O 880ml
3. 1x TE
  10x TE 100 ml
  dH 2 O 900ml
PBS-T
PBS，含有0.1％Tween-20
封闭缓冲液（50ml）
将2.5g脱脂奶粉与50ml 1x PBS-T混合
一级抗体稀释缓冲液
在含有0.02％叠氮化钠的PBS-T中以1:2000稀释的第一抗体（CPD和6-4PP的小鼠单克隆抗体）
二抗缓冲液
在封闭缓冲液中以1:2,500稀释的二抗（抗小鼠IgG HRP-缀合物）

致谢

这项工作得到了国家卫生和医疗部癌症控制国家R& D项目的资助。韩国大韩民国（1420070）和韩国国家研究基金会（NRF-2011-0013804和NRF-2013-R1A2A2A04008115）和大脑釜山21项目。

参考文献

Kang，T.H.，Reardon，J.T.and Sancar，A。（2011）。通过XPA蛋白的转录和转录后控制来调节核苷酸切除修复活性。 Nucleic Acids Res 39（8）：3176-3187。