材料和试剂

设备

程序

从患者血清中扩增HBV RT结构域

用引物组成后扩增HBV RT结构域

运行PCR如下：95℃5分钟，然后是95℃的30个循环 50秒，62℃50秒，72℃1分钟20秒，和最终延伸在72℃下10分钟
确定PCR产物（HBV RT结构域） 1％琼脂糖凝胶电泳（图2），并用Gel/PCR纯化 DNA提取试剂盒根据制造商的方案（最终洗脱体积为30μlTE缓冲液）。

HBV RT结构域的测序

如下所述在1.5ml管中混合连接反应物，并在4℃下孵育过夜

为了失活T4连接酶，将连接反应物在65℃下孵育15分钟并置于冰中
在步骤B2期间，从-80℃储存制备E.Coli （DH5α）感受态细胞，并置于冰中直至解冻。
转移50微升感受态细胞连接反应，在冰中孵育15分钟
在42℃的热块中热休克感受态细胞90秒，然后立即在冰中孵育15分钟。
从步骤B5加入500μlLB培养基，并在37℃下振荡孵育2小时
在室温下以3,000rpm离心管5分钟，然后取出350μl上清液
使用扩散器轻轻混合并将残余物上清液（约150μl）平板接种到AmpMacConkey琼脂平板上。
孵育板在37℃过夜，并检查白色的数量菌落（应观察到约100个菌落）
挑白色菌落，然后转移到2ml含有氨苄青霉素的LB培养基中在15ml管中并在37℃下振荡孵育过夜
从细菌中提取含有HBV RT结构域的DNA质粒使用LaboPass Plasmid Mini Purification Kit进行培养（步骤B10）按照制造商的方案并洗脱质粒在50微升EB 缓冲液（Kit中提供）或TE缓冲液
通过如下所述在37℃下同时消化反应2小时来确认正确的插入DNA

质粒DNA（200ng）
-

XhoI （20 U /μl）
0.25μl

NcoI （10 U /μl）
0.25μl

10x CutSmart ^TM缓冲区
1微升

蒸馏水
最多10μl

总计
10微升
通过T7（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG）对HBV RT结构域进行测序 GG-3'）和SP6（5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'）启动子引物（位于pGEM-T Easy载体）并分析突变比较 WT HBV（基因型C，GQ872210）。

将HBV RT结构域克隆入HBV 1.2复制子

同时消化200ng质粒[HBV RT质粒（步骤B12）插入DNA和HBV 1.2mer复制子用于载体DNA] 反应（参见方法C步骤12）。
识别1.2 kb（插入 DNA，步骤B12）和在0.8％琼脂糖凝胶上的4.8kb（载体DNA）片段电泳（图3），并用Gel/PCR DNA纯化消化的DNA 根据制造商的方案提取提取试剂盒（最终洗脱体积为30μlTE缓冲液）

如下所述在1.5ml管中混合连接反应物，并在4℃下孵育过夜

代表数据

图2.扩增的HBV RT基因的代表性数据。将来自患者血清的制备的HBV DNA用作模板。产品尺寸约为1.2 kb。

图3. HBV 1.2-mer复制子的确认。完整的HBV 1.2mer复制子用XhoI，NcoI限制酶消化，并在1％琼脂糖凝胶上分离。

食谱

致谢

这项研究由Konkuk大学支持。

参考文献

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本发明的另一个方面涉及一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：（1）。从慢性乙型肝炎患者分离的乙型肝炎病毒的clevudine抗性突变体的鉴定和表征 J Virol 84（9）：4494-4503。

Kim，J.H.，Park，Y.K.，Park，E.S.and Kim，K.H。（2014）。耐药性乙型肝炎病毒的分子诊断和治疗世界J Gastroenterol 20（19）：5708-5720。