材料和试剂

转染HBV 1.2mer复制子
1. Huh7细胞（肝脏研究中心，罗得岛医院，布朗医学院，普罗维登斯，美国）
2. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11995）
3. 胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：26140-079）
4. 青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140）
5. Lipofectamine 2000（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11668-019）
6. Opti-MEM I Reduced Serum Medium（Opti-MEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-088）
7. HBV 1.2mer复制子[WT或耐药HBV，WT HBV1.2复制子由韩国延世大学教授W. S. Ryu提供]
8. 拉米夫定（1〜100μM，由GlaxoSmithKline提供）
9. 阿德福韦（1〜100μM，由Gilead Sciences提供）
10. Clevudine（1〜100μM，Bukwang Pharmaceutical Co.提供）
11. 恩替卡韦（0.05〜1μM，Moravek）
12. 替诺福韦（1〜100μM，由Gilead Sciences提供）
从HBV核心颗粒提取病毒DNA
1. DNaseI（Takara Bio公司，目录号：2215B）
2. MungBean核酸酶（Takara Bio公司，目录号：2420B）
3. 蛋白酶K（Roche Diagnostics，目录号：03115801001）
4. 苯酚 - 氯仿 - 异戊醇25:24:1（Sigma-Aldrich，目录号：77617）
5. 醋酸钠三水合物（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：236500）
6. HEPES裂解缓冲液（见配方）
7. 核酸酶缓冲液（I）（参见配方）
8. 26％PEG溶液（参见配方）
9. 核酸酶缓冲液（II）（参见配方）
10. 0.5％SDS溶液（见配方）
Southern印迹测定和HBV探针的构建
1. 认证分子生物学琼脂糖（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-3102）
2. Amersham Hybond-N +膜（GE Healthcare，目录号：RPN203B）
3. SSC缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：85639）
4. 鲑鱼精子DNA（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9680）}
5. 聚乙二醇（PEG）（Sigma-Aldrich，目录号：P5413）
6. 50x Denhardt's溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D2532）
7. 0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）
8. 甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F7503）
9. HBV 1.2mer复制子
10. Klenow片段和10×Klenow缓冲液（Takara Bio Company，目录号：2140B）
11. dNTP（NEB，目录号：N0446S）
12. [α-32 P] dCTP（3000Ci/mmole，Perkin Elmer，目录号：BLU513H500UC）
13. 用于放射性标记DNA纯化的快速离心柱（Sephadex G-50，Roche Diagnostics，目录号：11 273 973 001）
14. Aat II （New England BioLabs，目录号：R0117S）
15. Hind III （New England BioLabs，目录号：R0104S）
16. 随机引物（Bioneer，目录号：N-7052）
17. （Amresco，目录号：0404）。
18. NaH 2 PO 4（Amresco，目录号：0571）
19. 0.1 M磷酸钠缓冲液（见配方）
20. 转移溶液（I）（参见配方）
21. 转移溶液（II）（参见配方）
22. 转移溶液（III）（参见配方）
23. 100mm细胞培养皿（Nunc ，目录号：172958）
24. 6孔板（Nunc ，目录号：140675）
25. 离心机（Eppendorf，目录号：5415R）
26. Pipet Aid XP（Drummond Scientific Company）
27. 电泳系统（Nihon Eido，目录号：NB-1011）
28. 干燥炉
29. 杂交瓶
30. 杂交室
31. 热块
程序
1. HBV 1.2mer复制子的转染
  1. 转染前一天，将每孔3×10 5个Huh7细胞平板接种于2ml 的生长培养基（具有10％FBS，1％青霉素 - 链霉素的DMEM）孔板。
  2. 转染前2小时，在80％细胞汇合时，每孔更换2ml生长培养基
  3. 稀释2微克的HBV 1.2mer复制子在125微升的Opti-MEM和轻轻地。
  4. 稀释4微升Lipofectamine 2000在125微升Opti-MEM，轻轻地轻弹。然后，在室温下孵育5分钟
  5. 孵育5分钟后，合并稀释的HBV 1.2mer复制子与稀释的Lipofectamine 2000并通过吸移轻轻混合。然后，在室温下孵育20分钟
  6. 4〜6小时后转染，每孔更换2ml生长培养基适当浓度的抗HBV药物（见图2）
  7. 更换生长培养基用抗HBV药物每天4天，然后通过在3,000rpm离心1小时收获在1.5ml管中的细胞 min。
2. 核心颗粒相对HBV DNA的提取
  1. 加入100微升冷HEPES裂解缓冲液的细胞沉淀，并在冰上孵育20分钟
  2. 在4℃下以13,000rpm离心裂解物10分钟并转移上清液（细胞裂解物，细胞质级分）装入新的1.5ml管中
  3. 通过移液混合5.67μl核酸酶缓冲液（I），并在37°C水浴中孵育30分钟。
  4. 简要旋转，加入40μl的26％PEG溶液，孵育2小时在冰上（每30分钟涡旋）并在13,000rpm离心30分钟在4℃
  5. 弃去上清液并在4℃下以13,000rpm离心5分钟
  6. 完全除去上清液（使用移液管和KIMTECH科学刮水器）
  7. 加入100μl核酸酶缓冲液（II），并物理重悬核心颗粒
  8. 在37℃水浴中孵育20分钟，并短暂旋转
  9. 加入282.5μl的0.5％SDS溶液和12.5μl蛋白酶K（20 mg/ml）并在37℃水浴中孵育2〜4小时（每30℃反转） min）。
  10. 离心后，加入400μl苯酚 - 氯仿 - 异戊醇酒精并剧烈涡旋10秒。然后，以13,000rpm离心在室温下搅拌5分钟
  11. 将上层水层转移到新的1.5 ml试管中
  12. 加入40μl的3M NaOAc和800μl的100％乙醇。反转后数次，在-20℃下将混合物沉淀过夜
  13. 在4℃下以13,000rpm离心30分钟，弃去上清液
  14. 加入800μl的70％乙醇，轻轻翻转
  15. 在4℃下以13,000rpm离心10分钟，弃去上清液
  16. 加入800μl的100％乙醇，轻轻翻转
  17. 在4℃下以13,000rpm离心10分钟，弃去上清液
  18. 干燥HBV DNA沉淀5〜10分钟（风干），溶于15μlTE缓冲液。将HBV DNA储存在4°C直至使用。
3. Southern印迹测定（凝胶转移）
  1. 在89％的0.8％琼脂糖凝胶上分离HBV DNA（步骤B，步骤18）2小时
  2. 电泳后，将凝胶转移至托盘，加入转移溶液（I）以浸泡凝胶
  3. 在振荡器上孵育10分钟，并用蒸馏水冲洗凝胶
  4. 加入转移溶液（II），并在摇床上孵育45分钟
  5. 用蒸馏水冲洗并加入转移溶液（III）
  6. 在振荡器上孵育30分钟，并用蒸馏水冲洗凝胶
  7. 使用毛细管将凝胶转移至Hybond-N +膜过夜方法（图1），并烘烤膜固定HBV DNA 2小时 80℃干烤箱。
  8. 将膜置于杂交瓶中用25ml杂交溶液并孵育膜4小时 42℃杂交室（预杂交步骤）。
4. HBV探针的构建
  1. 为了构建HBV特异性探针的模板，消化HBV 1.2mer 在37℃下用< em> Aat II和< em> Hind III< （Ahn et al。，2015）。
  2. 为了合成HBV特异性探针，将48ng模板（步骤8）和80ng随机引物混合在50μl蒸馏水中。
    注意：步骤10应在预杂交步骤中进行。
  3. 在100℃下加热探针混合物5分钟，在冰上快速冷却5分钟
  4. 离心后，加入5ul 10x Klenow缓冲液，2.5μldNTPs 混合物（2.5mM，除了dCTP），5μl的32P标记的dCTP（50μCi= 5 μl/标记）和1μl的探针混合物中的Klenow片段
  5. 在37℃下孵育探针混合物30分钟
  6. 使用快速旋转柱进行放射性标记的DNA纯化，去除未标记的探针。
5. Southern印迹测定（膜杂交）
  1. 用^{32 P标记的HBV替代预热的25ml杂交溶液探针并在42℃杂交室中孵育过夜}
  2. 杂交步骤后，用洗涤溶液（I）在63℃杂交室中洗涤膜15〜20分钟。
    注意：如果需要更多的洗涤步骤，请重复用洗涤液洗涤（II）。步骤9〜16应在无线电同位素室中进行。
  3. 将膜暴露于膜并在-80℃深冷冻箱中孵育过夜。然后，显影膜。
代表数据

图1.用于Southern印迹的毛细管转移方法方案

图2.耐药性HBV的体外易感性测定（Kim等人，2014）。耐药性HBV的复制是通过Southern印迹进行分析。 TDF和ETV用如下表（下面）的浓度处理。

食谱
1. HEPES裂解缓冲液
  10mM Hepes（pH7.5） 100 mM NaCl
  1mM EDTA
  1％NP-40
2. 核酸酶缓冲液（I）
  10mM CaCl 2
  12mM MgCl 2/
  DNaseI 0.5单位
  绿豆核酸酶7.5单位
3. 26％PEG溶液
  1.2 M NaCl
  60 mM EDTA
  30％蔗糖 26％PEG 8000
4. 核酸酶缓冲液（II）
  10mM Tris（pH7.5） 8mM CaCl 2
  6mM MgCl 2/v/v DNaseI 2单位
  绿豆核酸酶3单位
5. 0.5％SDS溶液
  25mM Tris（pH7.5） 10 mM EDTA
  100 mM NaCl
  0.5％SDS
6. 0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0） 57.7ml的1M Na 2 HPO 4
  42.3ml的1M NaH 2 PO 4·dub/d
7. 转移溶液（I）
  0.25 N HCl
  0.6 M NaCl
8. 转移溶液（II）
  0.5 M NaOH
  1 M NaCl
9. 转移溶液（III）
  1 M Tris（pH 7.5〜8.0）
  1 M NaCl
10. 杂交溶液
  甲酰胺25ml
  20x SSC 12.5ml
  0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）2.5ml
  0.5M EDTA 0.2ml
  50x Denhardt溶液3ml
  10％SDS 1ml
  鲑精DNA（10mg/ml）1ml
  蒸馏水4.8ml
11. 洗涤溶液（I）
  2x SSC
  0.1％SDS
12. 洗涤溶液（II）
  0.5x SSC
  0.1％SDS
致谢

这项研究由Konkuk大学支持。

参考文献
1. A，SH，Park，YK，Park，ES，Kim，JH，Kim，DH，Lim，KH，Jang，MS，Choe，WH，Ko，SY，Sung，IK，Kwon，SY和Kim，KH 。乙型肝炎病毒聚合酶rtA181T突变对复制和耐药性的影响可能受表面基因重叠变化的影响。 J Virol 88（12）：6805-6818。
2. Ahn，S.H.，Park，Y.K.and Kim，K。（2015）。将患者分离的HBV RT序列引入和测序到HBV 1.2-mer复制子中。生物协议 5（8）：e1449。
3. Kim，J.H.，Park，Y.K.，Park，E.S.and Kim，K.H。（2014）。耐药性乙型肝炎病毒的分子诊断和治疗世界J Gastroenterol 20（19）：5708-5720。
4. 本发明的另一个方面涉及一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：（1）。鉴定和表征从慢性乙型肝炎患者分离的乙型肝炎病毒clevudine抗性突变体。 a> J Virol 84（9）：4494-4503。