材料和试剂

均质植物组织
液氮
30％丙烯酰胺原液（29:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0156）
TEMED（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0801）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
2D Quant Kit（GE Healthcare，目录号：80-6483-56）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甘油
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8532）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
NaH 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：71505）
N，N-二甲基甲酰胺（Fluka，目录号：72438）
快蓝B盐（Sigma-Aldrich，目录号：D9805）
棕榈酸α-萘酯（Sigma-Aldrich，目录号：N9875） - 棕榈酸萘酯目录号：N9875不再适用于Sigma-Aldrich，但可在Santa Cruz Biotechnology，目录号：CAS 15806- 43-6。
提取缓冲液（参见配方）
12％分离凝胶（见配方）
4％堆积凝胶（见配方）
2 x SDS样品缓冲液（见配方）
1 M磷酸钠缓冲液（见配方）
开发解决方案（参见配方）

设备

软件

程序

组织匀浆和蛋白质提取
注意：不要在任何时候使样品变性。蛋白质必须保持其天然的折叠状态。
1. 使用预冷的研钵和杵将组织（0.2g）均质化成在液氮中的非常细的粉末。
2. 转移粉末到2毫升微量离心管，加入1.5毫升提取缓冲液，并使用涡旋混合均匀（见注3）注意：如果样品立即使用或正确储存，则不需要使用蛋白酶抑制剂。
3. 使用磁力搅拌器在4℃下在管状玻璃小瓶中搅拌样品1小时。
4. 在4℃下以13,500×g离心30分钟。
5. 离心后，收集上清液。
6. 量化提取物并制成等分试样。
  注意：使用2D Quant Kit按照制造商的说明测量蛋白质浓度。
SDS-PAGE
1. 将蛋白质样品（每个样品约25μg）与等体积的2x SDS样品缓冲液混合。不要随时加热。
2. 加载蛋白质样品并在12％分离凝胶上进行SDS-PAGE。
脂肪酶活性的凝胶检测
1. 通过洗涤从聚丙烯酰胺凝胶中除去SDS三次在含有0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.0）的溶液中各30分钟，和2.5％（v/v）Triton X-100
2. 在37℃下在黑暗中的显影溶液中孵育凝胶30分钟。
3. 用蒸馏水在振荡器上洗涤凝胶三次，每次10分钟。
4. 凝胶可以在4℃下在蒸馏水中保存两个月，而染色强度没有显着损失
5. 为了量化脂肪酶活性的水平，使用Quantity One软件可用于测量出现棕色带的密度。

食谱

致谢

这项工作得到了西班牙科学和创新部（MICINN）（ERDF-共同融资项目AGL2008-00517）和Junta deAndalucía（ERDF-共同融资项目P2010-CVI5767）的支持。

参考文献

Rejon，J.D.，Zienkiewicz，A.，Rodriguez-Garcia，M.I。和Castro，A.J。（2012）。橄榄油（
Zienkiewicz，A.，Zienkiewicz，K.，Rejon，J.D.，Alche Jde，D.，Castro，A.J。和Rodriguez-Garcia，M.I。（2014）。橄榄种子蛋白体储存降解酶，参与油体的动员。 J Exp Bot 65（1）：103-115。